Вставки ДНК лигирование вектора

ЛИГИРОВАНИЕ ВЕКТОРА СО ВСТАВКОЙ [c.286]

Помимо лигирования вектора и вставки может [c.287]

Лигирование вставки и вектора. Напомним, что ДНК-лигаза со//не способна катализировать воссоединение фрагментов с тупыми концами (разд, 4,5), [c.288]

Определение размера вставки в рекомбинантной молекуле ДНК. А. Обращение процессов, которые использовались для лигирования вектора со вставкой при [c.318]

Чтобы получить максимальный выход нужных кольцевых гетеродимеров, важно, чтобы немодифицированная вставка присутствовала в реакции лигирования в правильном соотношении / г. Поскольку вектор модифицирован щелочной фосфатазой, он может быть лигирован только с немодифицированными концами [c.56]

После того как получены вектор и вставка, можно приступать к конструированию рекомбинантных ДНК. Обычно нужно осуществить только два двухцепочечных соединения независимо от того, представляет ли собой вектор линейную плазмиду или вирусный геном или два плеча ДНК фага X объединены в одну линейную молекулу по со5-сайтам. Если вставки имеют тупые концы, то перед лигированием для его облегчения к ним часто присоединяют липкие концы. [c.286]

Лигирование по тупым концам менее эффективно, чем лигирование липких концов, и проводится в других условиях инкубации. Ниже описана методика постановки реакции для липких концов на примере вектора рВ1п19 и ЯгпйШ-фрагмента СаМУ- at в качестве вставки. Кроме того, приведена и методика лигирования по тупым концам. [c.58]

Нерасщеилеииый вектор Расщепленный вектор Расщепленный и дефосфорилироваи иый вектор Расщепленная вставка Десятикратный буфер для лигирования [c.59]

Л. Предполагаемые размеры фрагментов после расщепления ЕсоШ рекомбинантных плазмид, образующихся в результате единичной вставки фрагмента в двух возможных ориентациях и четырех возможных иариантов лигирования двух тандемных вставок в исходном векторе. [c.69]

Рассказывая о клонировании фрагмента ДНК, мы подразумевали, что нам доступен искомый ген или известна молекулярная масса фрагмента, который можно извлечь из электрофореграммы рестриктов ДНК. В действительности для получения нужного гена чаще всего необходимы поиски, и порой достаточно сложные. Для этого геномную ДНК, разрезанную выбранной рестриктазой, смешивают с ДНК вектора, вскрытого той же рестриктазой по уникальному сайту. В результате взаимодействия липких концов и последующего лигирования получают смесь рекомбинантных ДНК. После этого полученные плазмиды со вставками различных участков ДНК необходимо расклонировать. [c.275]

Щелочные фосфатазы бактерий (ВАР) и кишечника теленка ( IAP) катализируют удаление 5 -фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению З -концевой радиоактивной метки З2р а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5 -концевого фосфата. Удаление 5 -концевых фосфатных групп молекул вектора, линеаризованных с помощью одной рестриктазы во время подготовки его для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки. Гены секретируемых щелочных фосфатаз находят применение и в качестве высокочувствительных генов-репортеров при исследовании функционирования регуляторных элементов различных генов в прокариотических и дрожжевых системах экспрессии, а также в клетках млекопитающих [91]. [c.65]

Система для секвенирования ДНК методом дробовика , основанная на разработанном одноцепочечном векторе, несущем удобный полилинкер, вызвала к жизни способ получения небольших фрагментов ДНК для их последующего клонирования с помощью частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания (рис. 8.4) [Messing et al., 1981]. Преимуществом этого способа можно считать относительную легкость этапа лигирования при условии использования рестрикционных эндонуклеаз, образующих фрагменты ДНК с липкими концами. Что касается лигирования рестрикционных фрагментов ДНК, несущих тупые концы, то и в этом случае не требовались дополнительные этапы, предшествующие лигированию, в отличие от других методов получения коротких фрагментов ДНК, рассматриваемых ниже. Главный недостаток данного подхода заключается в том, что сайты используемых рестрикционных эндонуклеаз могут быть расположены не очень равномерно и, таким образом, существует вероятность получить какой-нибудь субклон, несущий вставку довольно крупного размера, не позволяющую осуществить ее прочтение за один эксперимент. [c.241]

Ранее был предложен имеющий много общего с описанными выше методами подход к получению делеционных субклонов в одноцепочечном векторе, основанный на построении с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I комплементарной цепи участков вставки, имеющих разную протяженность [Burton et al., 1988]. В цитируемой работе осуществлялся отжиг олигонуклеотидного праймера, в результате ферментативного удлинения которого происходило увеличение двуцепочечного участка вставки, причем производимый по времени отбор аликвот данной реакции обеспечивал получение их разной протяженности (рис. 8.14). Далее остающийся недостроенным одноцепочечный участок вставки и самого вектора удалялся нуклеазой S1. Затем с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, сайт которой находился в полилинкере поблизости от места клонирования вставки, вырезались делетированные варианты вставки. Их дальнейшее лигирование с заранее приготовленным вектором проводилось с таким расчетом, что происходила реориентация вставки, позволяющая секвенировать фрагменты ДНК со стороны делеций, давая, таким образом, возможность получить перекрывающиеся участки секвенируемой последовательности ДНК. [c.263]

Подобное получение серии субклонов с требуемыми размерами укороченной вставки при раздельном лигировании элюированных из геля образцов ДНК и их независимой трансформации возможно только с использованием вектора, в нуклеотидной последовательности которого отсутствуют сайты расщепления для тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, каковым и является фагмидный вектор pSequoiaT12, поскольку при наличии в векторной последовательности сайтов узнавания фермента, используемого для недорестрикции, образуется чрезмерно сложная картина электрофоретического разделения, в которой выбрать необходимые полосы не представляется возможным. [c.278]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология