Геномная библиотека, скрининг

Для идентификации нужного гена человека используют четыре метода. В первом из них, функциональном картировании, на основе данных о генном продукте синтезируют зонды для скрининга кДНК-библиотеки. Положительный кДНК-клон, содержащий кодирующую область гена-мишени, используют для отбора геномных клонов и характеристики гена в целом. Второй подход, кандидатное картирование, основывается на выборе генов, которые по имеющимся [c.480]

Рис. 4.14. Иммунологический скрининг геномной библиотеки (иммунологическое тестирование колоний). Клетки после транстформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроиеллю-лозный или найлоновый фильтр) так, чтобы их расположение в точности соответствовало таковому на чашке.

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмидами в них можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания геномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг. [c.76]

Иммунологический скрининг В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологиче- [c.67]

Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга геномной библиотеки необходимо определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген. [c.68]

Скрининг библиотек геномных ДНК обычно проводят по следующей схеме. После трансформации высевают клетки на чашки с питательной [c.67]

Хотя коллега и увлекающийся человек, но он ваш друг, поэтому вы откликаетесь на его идею, пообещав позвонить через 15 мин, как только переведете аминокислотную последовательность в нуклеотидную. Какие два набора олигонуклеотидов размером по 20 нуклеотидов вы порекомендуете другу-коллеге в качестве наилучших зондов гибридизации для скрининга библиотеки геномной ДНК [c.44]

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

Скрининг библиотек. После того как радиоактивный зонд получен, просматривают геномную библиотеку или библиотеку кДНК для идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду и, следовательно, соответствующей анализируемому белку. [c.46]

Для решения целого ряда задач желательно иметь способ, позволяющий легко выделять рекомбинантный провирус из инфицированных клеток путем молекулярного клонирования. В частности, это относится к использованию ретровирусных векторов для удаления интронов, так как клонирование провируса дает возможность после инфекциононго цикла получать кДНК-копии интересующего нас гена. Кроме всего прочего клонирование провируса наилучшим образом позволяет исследовать и подтвердить генетическую структуру любой ретровирусной конструкции после того, как она претерпела цикл вирусной репликации. Клонирование провирусов включает обычные генноинженерные манипуляции, в том числе создание геномной библиотеки и ее скрининг гибридизационными методами. Однако заметим, что это непростая задача ввиду того, что обычно лишь одна копия искомого провируса присутствует в клеточном геноме. [c.300]

Зонд (проба). Молекула, используемая для выявления специфических фрагментов ДНК, РНК или белка при блот-анализе. (Например, при скрининге геномных библиотек). Зондами могут служить молекулы кДНК, синтетические олигонуклеотиды или специфические антитела. [c.51]

В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга космидных библиотек, а также для опытов типа прогулка вдоль хромосомы . Прогулка вдоль хромосомы определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК. В большинстве случаев такая прогулка осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой прогулки . [c.17]

В том случае, если в каждом праймере содержатся рестрикционные сайты, клонируют ПЦР-продукт, несущий пойманный экзон, и используют последний в качестве зонда для скрининга кДНК-библиотеки. Зная нуклеотидную последовательность пойманного экзона, предпринимают поиск гомологичных ему последовательностей в базе данных. Если есть основания полагать, что пойманный экзон с большой вероятностью является частью гена данного заболевания, то характеризуют и секвенируют геномные клоны, охватывающие место расположения данного гена, и исследуют образцы ДНК больных и здоровых индивидов с целью выявления мутаций. Поскольку мутации, ответственные за патологию, не всегда бывают равномерно распределены по всем экзонам, чем больше размер сканированной кодирующей области предполагаемого гена, тем больше вероятность обнаружения мутации. [c.476]

Internet Line). Они созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна из них - ожидаемая нуклеотидная последовательность кодирующей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов. Нуклеотидную последовательность предполагаемого экзона можно использовать для поиска гомологичных ей последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью гена-мишени. [c.476]

Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отнощению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК, присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0,lXSS , 0,1%-ноге ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов). [c.35]

Наличие в геномах человека и шимпанзе последовательностей, имеющих частичное сходство с различными генами HIV-1, первоначально тестировали с помощью блот-гибридизации в мягких условиях, позволяющих выявлять последовательности, сходство которых с генами ВИЧ составляет от 60% и выше. В очень мягких условиях гибридизации геномных ДНК человека и шимпанзе с перекрывающимися генами tatirev наблюдали в основном диффузное распределение сигнала. При более жестких условиях отмывки фильтров диффузный гибридизационный сигнал уменьшался и были обнаружены дискретные положительные сигналы как с ДНК человека, так и с ДНК шимпанзе. Наличие дискретных гибридизующихся фрагментов не исключает существование и других последовательностей, имеющих сходство с генами tat/rev, которые представлены менее часто встречающимися фрагментами других размеров. Об этом свидетельствуют полуколичественные данные гибридизации в точках, согласно которым общее число tatlrev-no-добных элементов в геноме человека составляет около 10 . Сходное значение было получено и при скрининге тотальной библиотеки генов человека (102-103). Эти оценки совпадают с теми, которые можно рассчитать на основании данных гибридизации с фильтрами высокой плотности, на которых нанесен ранжированный банк генов хромосомы 19. Около десятка рекомбинантных космид гибридизовалось в мягких условиях с зондом tatirev. Учитывая, что хромосома 19 содержит примерно 1/50 часть генома, можно рассчитать, что общее количество тг/геу-подобных элементов в геноме человека составляет около 5 х Ю . [c.173]

Субклонированную клеточную ДНК использовать для скрининга библиотеки геномной ДНК (и/или библиотеки кДНК), полученной от нормальных мышей. Эти клоны содержат в неизмененном виде интересующий ген. [c.497]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология