Зонд для выявления нуклеотидных замен

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

ГО электрофореза в агарозном геле. При этом в ряде случаев не удается полностью разделить гибриды РНК—ДНК и результаты получаются противоречивыми, так как фрагменты РНК, полученные при расщеплении ее по неспаренным участкам, но оставшиеся связанными с ДНК, обнаруживаются в геле в зонах, соответствующих длине всего зонда. Для более эффективного выявления единичных нуклеотидных замен путем РНКазного расщепления мы использовали по несколько зондов в каждой реакции отжига/расщепления. Однако полученные таким способом результаты зачастую очень неоднозначны и с трудом поддаются интерпретации. В силу перечисленных причин при исследовании фрагментов ДНК на единичные замены мы бы рекомендовали использовать в реакциях РНКазного расщепления РНК-зонды длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. [c.128]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология