Рестрикция ДНК также Сайты рестрикции

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Рис. 4-61. Простой пример, иллюстрирующий взаимное расположение на двойной спирали ДНК участков узнавания для различных рестрицирующих нуклеаз (именуемых также сайтами рестрикции ), совокупность которых образует рестрикционную карту Заключение фермент А расщепляет вблизи одного из концов молекулы. Фермент Б должен расщеплять вблизи того же конца либо вблизи другого конца. Размеры фрагментов, образующихся при расщеплении 2 ферментами исключают первое предположение и позволяют установить порядок сайтов рестрикции, указанный ниже

Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепления нуклеотидной последовательности. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы III типа похожи на рестриктазы ] типа, они гидролизуют ДНК на расстоянии 20—35 н. п. от сайтов узнавания и также довольно редко используются практических целей. [c.26]

Соединение фрагментов по тупым концам. Тупые концы фрагментов ДНК, полученные после действия рестриктаз, производящих прямой разрез внутри сайта рестрикции, также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность на порядок ниже, чем при сшивке по липким концам. Однако преимущество соединения фрагментов с тупыми концами по сравнению с липкими 6 том, что не имеет значения, какие рестриктазы образовывали эти тупые концы фрагменты, образованные в результате действия разноименных рестриктаз, легко соединимы (рис. 1.5). [c.34]

После того как проведен подобный анализ всех фрагментов, становится ясно, что каждый фрагмент, полученный из исходных А-фрагментов под действием фермента В, можно также обнаружить в образцах, содержащих фрагменты, полученные в результате расщепления исходных В-фрагментов ферментом А. В геле, содержащем все продукты двойного расщепления (правый гель на рис. 3.2), каждый фрагмент встречается один раз. Эти данные позволяют однозначно расположить на карте сайты рестрикции. [c.45]

Один из таких приемов заключается в неполном расщеплении. В определенных условиях эксперимента рестриктаза узнает и расщепляет не все свои мишени в каждой молекуле ДНК. Например (рис. 3.3), при частичном расщеплении ДНК ферментом А могут образоваться фрагменты 3100 п.н., 1400 п.н. и 500 п.н. Сопоставив их с тем, что получается после полного расщепления, можно сразу расположить фрагменты 2100 п.н. и 1100 п.н. рядом, как составляющие фрагмента 3100 п.н. Таким путем можно последовательно расположить сайты рестрикции одного фермента. При неполной рестрикции можно также получить фрагмент 3500 п. н. тогда можно расположить рядом фрагменты 2100 п.н. и 1400 п.н. [c.46]

Другая возможность состоит в том, что в состав гена входит промежуточная последовательность (или последовательности), имеющая сайт узнавания рестриктазы. Действительно, наличие каждого интрона, содержащего такой сайт, приведет к образованию дополнительного фрагмента. (Противоположный результат, когда получают один фрагмент, не доказывает отсутствия промежуточной последовательности, поскольку интрон не обязательно содержит сайт рестрикции. Это также не исключает возможности существования небольшого числа расположенных рядом копий.) [c.251]

Оказывается, что задача уточнения физической карты (при произвольном числе рестриктаз) сводится к поиску оптимального контура в графе специального вида. На рис. 5.14 приведен взвешенный ориентированный граф, построенный по диаграмме - каждому сайту рестрикции на диаграмме (а также началу и концу линейной молекулы) соотвествует вершина в G, две вершины соединяются дугой веса 1, если расстояние между соответствующими сайтами на диаграмме известно и равно 1. [c.184]

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

Непосредственно для картирования сайтов рестрикции используют метод неполного гидролиза одной рестриктазой или метод нескольких, чаще всего двух рестриктаз. В случае неполного гидролиза молекулы, имеющей, например, два сайта рестрикции, будут получаться пять фрагментов — пять полос при электрофорезе плюс еще одна полоса интактных молекул (рис. 11.13, А). В простейшем случае по распределению молекулярных масс удается определить взаимное расположение фрагментов. Можно также извлечь из геля продукты неполного гидролиза и еще раз подвергнуть их действию рестриктазы. Если при этом (см. рис. 11.13, А) освобождается общий фрагмент В, то общее расположение фрагментов определяется АВС. [c.283]

Векторы, используемые для клеточной трансформации, представляют собой плазмиды, которые помимо участка начала репликации содержат один ген резистентности, применяющийся для селекции в клетках прокариот, и второй ген резистентности, который может использоваться для селекции в эукариотических клетках. Такие векторы имеют также несколько сайтов рестрикции, по которым и проводят клонирование нужного гена. Ряд векторов, обладающих этими свойствами, показан на рис. 4-1. [c.75]

Обозначены положения уникальных сайтов рестрикции, а также функционально значимых генов [c.75]

Небольшие делеции в окрестностях сайтов рестрикции можно получать быстрее удалением липких концов линеаризованной плазмидной ДНК после рестрикции с последующим замыканием линейной ДНК в кольцо лигированием по образовавшимся тупым концам. В этом случае размер делеции соответствует размеру одноцепочечных липких концов в сайтах рестрикции. Кроме того, такой метод допускает простую проверку наличия мутаций в требуемом участке ДНК, так как в результате мутации происходит потеря уникального сайта рестрикции. Для получения вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемые участки клонируемых генов также разработаны эффективные и надежные методы. В простейшем случае такая задача решается путем расщепления исследуемого гена рестриктазой по уникальному сайту рестрикции и встраивания по этому сайту фрагмента природной ДНК или синтетического двухцепочечного олигонуклеотида, который фланкирован соответствующими липкими концами. Лигирование может проводиться и по тупым концам. В таком случае последовательности нуклеотидов на концах вставки уже не имеют существенного значения для встраивания этого фрагмента по сайту рестрикции. [c.289]

Существование разновидностей повторяющейся единицы подразумевалось, когда мы называли исходный материал для анализа нуклеотидной последовательности сателлитной ДНК мономерным фрагментом. При расщеплении сателлитной ДНК ферментом, для которого имеется один сайт рестрикции в последовательности размером 234 п. н., образуются также димеры, тримеры и тетрамеры, обладающие сходством с последовательностью размером 234 п. н. Это происходит, когда повторяющаяся единица в результате мутации утрачивает сайт рестрикции. [c.305]

Фаг X также представляет собой хороший пример того, как можно использовать фрагменты, образующиеся при рестрикции (рестрикты) для описания структуры генома вируса. На рис. 9.6 можно видеть число и размеры фрагментов ДНК, образующихся при действии нескольких различных рестриктаз на геном этого фага. Последовательность фрагментов, образующихся при действии определенной рестриктазы, можно определить с помощью сочетания нескольких методов, цель которых состоит в построении карты сайтов рестрикции генома фага X. На рис. 9.7 схематически изображена карта сайтов E o RI и Hin dlll на фоне генетической и физической карт генома фага X. [c.271]

Независимо от этих методов антигены HLA-D можно типировать стандартным лимфотоксическим тестом, проводимым на обогащенных В-лимфоцитами клеточных суспензиях. В противоположность антигенам HLA-A, HLA-B и HLA- , которые экспрессируются на поверхности Т- и В-клеток, антигены HLA-D обнаруживаются преимущественно на В-клетках и макрофагах. Впрочем, пока еще остается открытым вопрос, полностью ли идентичны HLA-D-антигены, выявляемые СКЛ-типи-рованием и серологическими реакциями. На рис. 3.39 представлены биохимическая модель белков HLA и их топография на клеточной мембране. HLA-район анализировали также на молекулярном уровне с помощью методов рекомбинантных ДНК (разд. 2.3). Были идентифицированы и сек-венированы нуклеотидные последовательности генов основных классов HLA-антигенов и родственных им генов и псевдогенов, кроме того, обнаружен полиморфизм по сайтам рестрикции [621 652 839]. [c.217]

Одна из наиболее часто возникающих проблем при анализе биологических текстов - поиск гомологий. И это понятно, поскольку схожесть текстов позволяет делать выводы об их эволюционной и/или функциональной близости. Здесь можно привести пример обнаруженной гомологии между определенными типами онкогенов и клеточными генами (НаЬагго et а1., 1984), что привело к возникновению нового направления исследований. Гомологии между последовательностями часто используют для реконструкции эволюционных деревьев. Такие важные аспекты анализа биологических текстов, как поиск повторов, палиндромов, симметричных участков, сайтов рестрикции, также связаны с проблемой поиска гомологий. Анализ гомологий необходим также при подготовке и проведении целого ряда экспериментальных работ, в частности при синтезе олигонуклеотидных зондов для поиска клонов в клонотеке, стыковке фрагментов нуклеотидных последовательностей при секвенировании протяженных участков ДНК или целых геномов и др. [c.11]

Установление точек действия различных рестриктаз позволяет проводить физическое картирование участков молекулы ДНК и небольших геномов (плазмид вирусов). Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может быть использовано для его идентификации. Принцип рестрикционного картирования сводится к получению перекрывающихся по размеру фрагментов, которые разделяют при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Молекулярную массу фрагментов обычно определяют, используя в качестве свидетеля ДНК известного размера. На электрофо-реграмме рестрикты-фрагменты ДНК различают, окрашивая их бромистым этидием и просматривая гель в ультрафиолетовом свете. Применяют также радиоактивное мечение концов фрагментов с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. [c.283]

Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных или растений. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечи-ваюпдих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных или растений было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках высших эукариот, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы, помимо всего прочего, должны быть челночными векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток. [c.133]

В экспоненциальной фазе реакции (нижняя часть рисунка) рестриктаза BsoBl вносит одноцепочечный разрыв (обозначен треугольником) в верхнюю цепь ДНК, синтез которой был инициирован с праймера S], но не в НИЖНЮЮ цепь, поскольку последняя содержит в сайте рестрикции модифицированный остаток d MP (7) наличие одноцепочечного разрыва позволяет ДНК-полимеразе (обозначена звездочкой) инициировать синтез ДНК в этом месте и построить новую цепь ДНК, вытеснив дочернюю из дуплекса, при этом происходит восстановление немодифицированного сайта рестрикции, который по-прежнему остается измененным в нижней цепи (8-10), что дает возможность образованному дуплексу вступить в новый цикл синтеза ДНК, а вытесненная цепь также используется в качестве матрицы вначале с праймерами В2 и 2, а затем В и S], что обеспечивает экспоненциальный характер амплификации [c.245]

Ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Ва13. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате подобного действия образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К тупым концам Таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют Двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо по- едством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки. Точное картирование концов делеций осуществляют секвени-рованием соответствующих участков ДНК мутантных плазмид. В результате получают набор делеций разного размера, положе- [c.287]

Эндонуклеазы рестрикции класса II, которые обладают уникальной способностью расщеплять ДНК по специфическим сайтам рестрикции, широко используются в генной инженерии (см. раздел 2.1 в первой части книги). Кроме того эти ферменты являются излюбленным объектом фундаментальных исследований, в ходе которых предпринимаются попытки объяснения их высокой специфичности. В настоящее время имеются данные рентгеноструктурного анализа, по крайней мере, для 12 рестриктаз, в том числе свободных ферментов, а также ферментов в комплексе с ДНК, содержащими соответствующие сайты рестрикции, и неправильными ДНК-субстратами. Среди этих ферментов эндонуклеаза ЕсоКЧ наиболее хорошо изучена и чаще всего используется в белковой инженерии [319]. [c.442]

Использование рационального редизайна полипептидных цепей рестриктаз E oRl и E oRV с целью изменения их субстратной специфичности пока не завершилось успехом [320]. Замены аминокислотных остатков, вовлеченных в процесс распознавания субстрата, неизменно сопровождались снижением специфичности фермента и уменьшением его удельной активности. Предполагается, что сложная сеть ДНК-белковых взаимодействий при взаимодействии рестриктазы с ДНК формируется кооперативно, и любые вмешательства в эту сеть приводят к отрицательным последствиям. В настоящее время остаются в значительной степени непонятными энергетические характеристики динамических структур, формирующихся в комплексах фермент-ДНК, а также, что еще более важно, нет возможности количественной оценки влияния каждого контакта в таких комплексах на все другие контакты, то есть на кооперативность взаимодействий. Кроме того, на сегодняшний день отсутствует понимание структурных и термодинамических особенностей, а также функциональной роли альтернативных конформаций ферментов, которые он принимает в комплексах с частично измененными сайтами рестрикции и которые не может расщеплять. Однако без таких знаний трудно рационально воздействовать на специфичность действия рестриктазы. [c.443]

Транспозоны используют и с целью создания в нужных местах ДНК областей гомологии для Re A-зависимои рекомбинации, а также для внесения подходящих сайтов рестрикции (см. гл. 6) с цепью дальнейших генетических манипуляций in vitro. [c.62]

Смотреть страницы где упоминается термин Рестрикция ДНК также Сайты рестрикции: [c.132] [c.89] [c.132] [c.221] [c.240] [c.283] [c.16] [c.294] [c.23] [c.18] [c.165] [c.40] [c.161] [c.36] [c.74] [c.59] [c.72] [c.75] [c.93] [c.170] [c.443] [c.152] [c.171] [c.209]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология