Анализ аминокислот с помощью электрофореза

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

С помощью электрофореза на бумаге можно выделять препаративные и идентифицировать малые количества аминокислот. Кроме того, электрофорез на бумаге лежит в основе анализа сложных [c.95]

Анализ аминокислот с помощью электрофореза [c.30]

В пятидесятых годах, в период бурного развития БХ, был опубликован ряд статей с описанием методик и систем растворителей, предназначенных для разделения белковых гидролизатов или аминокислот, полученных из различных физиологических жидкостей (см. [51, 77]). Эти системы использовались для разделения сложных смесей аминокислот и пептидов и смесей аминокислот, с трудом поддающихся идентификации, например лейцин, изолейцин. С появлением автоматических аминокислотных анализаторов [120], а также новых ионообменников (см. гл. 5) БХ все реже и реже используют для анализа аминокислот и пептидов. В настоящее время в лабораториях, ведущих исследование белков, методом БХ проводят главным образом окончательную очистку простых смесей пептидов, полученных с помощью других методов разделения, кроме того, БХ служит одним из критериев однородности вещества (часто в сочетании с электрофорезом на бумаге), и только в считанных случаях ее применяют для идентификации отдельных аминокислот. [c.121]

Оси. работы посвящены исследованию адсорбции и электрофореза. Создал (1931 —1935) метод фронтальной адсорбционной хроматографии, с помощью которого смог анализировать качественно и количественно смеси, содержащие аминокислоты, пептиды, углеводы. В результате проведенных им (с 1935) исследований электрофореза разработал метод электрофоретического анализа биоколлоидов с его различными модификациями (микроэлектрофорез, электрофорез на бумаге, иммуноэлектрофорез). Применил электрофоретический метод для решения ряда прикладных задач биохимии — исследования и разделения нормальной и патологической сывороток, изучения чистых белков и их смесей, ферментов, нуклеопротеидов, нуклеиновых и аминокислот и др. С помощью иммуноэлектрофореза заложил основы изучения белковой структуры нормальной сыворотки крови, выделив из нее три различных белка (теперь их обнаружено более 20). [c.428]

В книге подробно рассматриваются автоматический метод анализа пептидов и белков с помощью ионообменной хроматографии, газожидкостная хроматография аминокислот и пептидов, очистка белков с помощью гель-фильтрации и электрофореза, изучение функциональных групп в белках с привлечением химических методов. Отдельная глава посвящена изучению четвертичной структуры белков. [c.2]

Для анализа белковых гидролизатов разработаны очень удобные хроматографические методы. Тем не менее электрофорез, особенно электрофорез на бумаге, очень часто применяют, когда смеси не очень сложны и когда имеющиеся в смеси аминокислоты значительно отличаются по кислотно-основным свойствам. Пример успешного разделения довольно сложной смеси приведен на рис. 16. Электрофоретическое разделение аминокислот можно провести очень быстро, особенно если применить высоковольтный электрофорез. Проявление электрофореграмм осуществляют с помощью нингидрина. [c.105]

Важнейшая характеристика всех белков — качественный и количественный аминокислотный состав их гидролизатов, который оценивается теперь преимущественно методами хроматографии и электрофореза. Эти методы разделения и идентификации суммы аминокислот достаточно многообразны и в ряде случаев отличаются высокой эффективностью. Ниже приводится один из упрощенных вариантов анализа гидролизата белка гороха при помощи хроматографии в тонком слое сорбента и электрофореза на бумаге. [c.245]

Белки в пробе можно коагулировать, например нагреванием. Липиды, воски, парафины и другие липофильные соединения удается отделить от гидрофильных компонентов методом экстракционного разделения между фазами петролейного эфира и водных спиртов (например, 60- и 95%-ного метанола в зависимости от природы веществ) в одной делительной воронке или в нескольких, применяя метод противоточного распределения. Различные виды аминокислот (основные, кислые и нейтральные) можно предварительно разделить посредством электрофореза на бумаге или в геле. Для отделения различных органических кислот и ряда соединений типа фенолов от сахароподобных веществ пригодны даже такие старые методы, как осаждение ацетатом свинца, основным ацетатом свинца и т. п. Некоторые группы алкалоидов можно высадить из экстрактов с помощью специфических реагентов, а затем выделить их. В тех случаях, когда представляют интерес органические вещества средней полярности, можно иногда очистить пробу непосредственно на бумаге, на которой должен проводиться хроматографический анализ. Неочищенную пробу хроматографируют сначала чистым петролейным эфиром (иногда несколько раз), липиды при этом перемещаются вместе с фронтом растворителя. Далее хроматограмму сущат, после этого можно хроматографировать пробу еще раз чистой водой, если целевое вещество полностью нерастворимо в ней. Вода вымывает из пробы соли, сахара, аминокислоты и т. д., которые перемещаются вместе с фронтом элюента или вблизи него. В заключение пробу хроматографируют специально подобранным элюентом, следя при этом, чтобы фронт растворителя не продвинулся на такое же расстояние, как при предыдущих операциях по очистке. [c.88]

Замена одной аминокислоты В 1956 г Ингрэм работал в Кэмбридже, в той лаборатории, где до этого Перутц исследовал кристаллографию белков, Сэнгер определил аминокислотную последовательность инсулина, а Крик и Уотсон предложили свою модель структуры ДНК Ингрэму удалось точно определить, чем нормальный гемоглобин отличается от серповидноклеточного [1138] При гидролизе молекулы глобина трипсином, расщепляющим белки, образуется около 60 пептидов, которые были разделены в двумерной системе на бумаге в одном направлении с помощью электрофореза, а в другом-с помощью хроматографии Этим методом (его называют методом отпечатков пальцев ) удалось показать, что гемоглобин серповидных эритроцитов отличается от нормального по подвижности единственного пептида При дальнейшем анализе этого пептида выяснилось, что гемоглобин серповидных эритроцитов отличается от нормального только по одной аминокислоте, глутамино- [c.71]

Разделить с помощью одной лишь хроматографии эту сложную смесь продуктов частичного расщепления цепи — аминокислот, дипептидов, трипептидов, тетрапептидов и т. д. — было очень трудно. Зангер и Туппи применили другие методы разделения (электрофорез и адсорбцию на угле и на ионообменных смолах), с помощью которых они разделили пептидные обломки на группы. Теперь они подвергали анализу уже эти более простые смеси с помощью хроматографии на бумаге. Им удалось выделить из разрушенной цепи 22 дипептида, 14 трипептидов и 12 более крупных обломков (см. фиг. , А). Хотя эти вещества были получены лишь в микроскопических количествах, тем не менее специальными методами они были идентифицированы и была установлена последовательность расположения образующих их аминокислот. [c.97]

Небольшие порции каждой из полученных фракций анализируют методом высоковольтного электрофореза на бумаге, у условно чистых пептидов определяют Ы-концевую аминокислоту и иногда частичную аминокислотную последовательность по методу Эдмана в дансильном варианте (гл. 11). Из фракций, содержащих гомогенные по всем показателям пептиды, отбирают аликвоты на аминокислотный анализ, после чего их лиофилизуют. Крупные пептиды (20—50 остатков), даже чистые, часто проявляются на электрофореграммах в виде диффузных полос в отличие от небольших фрагментов, получающихся при их гидролизе, образующих четкие зоны при электрофорезе. Это позволяет при повторной фрагментации небольшой порции материала из условно чистых пиков хроматограммы обнаружить с помощью электрофореза наличие в них минорных компонент, не регистрируемых другим путем. Крупные пептиды, загрязненные примесями, могут быть успению очищены на ДЭАЭ-целлюлозе, хотя выходы при этом бывают довольно низкими. Поскольку для установления или контроля аминокислотной последовательности крупного пептида, как правило, необходимо проведение дополнительного гидролиза, целесообразно две трети очищенного материала оставить для этих целей. Даже [c.353]

Во многих случаях можно предполагать, что каждая субъединица образована одной полипептидной цепью. Если это не так, то можно подобрать условия, при которых все индивидуальные полипептидные цепи в четвертичной структуре разделяются. Для разделения обычно используют сильные денатурирующие агенты, такие как додедилсульфат натрия, и обработку восстанавливающими агентами для разрущения всех дисульфидных связей. Часто все получающиеся остатки цистеина алкилируют иодуксусной кислотой или иодацетамидом для предотвращения восстановления дисульфидных связей при последующих измерениях. Методы разделения почти всегда дают возможность определить число различных типов полипептидных цепей. Например, с помощью электрофореза часто разделяют белки, которые абсолютно идентичны, за исключением единичных зарядовых различий. Молекулярную массу каждой из денатурированных цепей (Л/ ) можно определить гидродинамическими методами, хотя и не всегда с такой же точностью, как в случае нативных белков. В качестве альтернативы используют химические методы для определения числа аминокислот, приходящегося на один Ы-конец. Вместе с аминокислотным анализом это дает возможность достаточно точно определить молекулярную массу цепи. [c.130]

Были также разработаны ультрамикрометоды, основанные на сочетании двойного изотопного разбавления, бумажной хроматографии и электрофореза [193]. В настоящее время для полного аминокислотного анализа требуется только 2 мкг белка. Первоначально аминокислоты метили с помощью и содержащихся в г-иодфенилсульфонилхлориде, получая при этом их шипсильные производные [94]. Однако в дальнейшем оказалось более удобным получать изотопы с более длинным периодом полураспада для этого аминокислоты ацетилировали уксусным ангидридом, содержащим тритий и [193]. [c.402]

Смит и др. [152] исследовали три обычных подтипа гаптоглобина с целью определения N-концевых групп. Во всех случаях были идентифицированы валин и изолейцин, что указывает на присутствие в молекуле гаптоглобина двух полипептидных цепей. После восстановительного расщепления гаптоглобина с помощью меркаптоэтапола в мочевине [150, 151] было установлено, что одна из полипептидных цепей, изолейцил- или -цепь, идентична во всех подтипах гаптоглобина, а валил- или а-цепи различны по свойствам при электрофорезе на различных системах крахмального геля. Аминокислотный анализ и исследование пептидов, полученных в результате обработки гаптоглобина химотрипсином [151], показали, что наблюдаемые различия частично могут быть обусловлены замещением аминокислот. [c.252]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология