Линкеры олигонуклеотидные

И самого проведения этапа лигирования является то, что в образовавшуюся брешь между противоположными концами вставки встраивают синтетический участок ДНК небольшой протяженности, формируемый за счет отжига двух комплементарных олигонуклеотидных праймеров и имеющий тупые концы. Впоследствии обе цепи этого линкера служат, прежде всего, местами отжига этих же олигонуклеотидов, выступающих уже в роли секвенирующих праймеров, что позволяет секвенировать обе цепи клонированного фрагмента ДНК в противоположных направлениях. Другое предназначение данного линкера заключается в отборе с его помощью укороченных делеционных вариантов исходной [c.255]

Расщепление химерных белков В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, причем последний вариант встречается нечасто. Например, из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике, а сам продукт клонированного гена-мишени может оказаться неактивным. Кроме того, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта. Один из таких способов основан на присоединении белка, кодируемого геном-мишенью, к белку клетки-хозяина, содержащему короткий пептид, распознаваемый специфической протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, олигонуктеотид, кодирующий пептид Пе-01и-01у-Аг . После синтеза и очистки химерного белка для отделения белкового продукта, кодируемого клонированным геном, можно использовать фактор свертывания крови Х , который является специфической протеиназой, разрывающей пептидные связи исключительно на С-конце последовательности Ile-Glu-Gly-Arg (рис. 6.6). Более того, поскольку такой пептид [c.112]

Ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Ва13. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате подобного действия образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К тупым концам Таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют Двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо по- едством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки. Точное картирование концов делеций осуществляют секвени-рованием соответствующих участков ДНК мутантных плазмид. В результате получают набор делеций разного размера, положе- [c.287]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология