Клонирование фрагментов

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДНК в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помощью одного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

Рис. 10.9. Разделение клонированных фрагментов ДНК человека с помощ,ью электрофореза в агарозном геле и идентификация фрагментов, содержащих

Геномная библиотека, банк (библиотека) генов (Genome lihrary) Набор клонированных фрагментов ДНК, в совокупности составляющих индивидуальный (групповой, видовой) геном. Если речь идет о крупном геноме (млекопитающие), то получают хромосомоспецифичные библиотеки. [c.546]

Все перечисленные этапы составляют сущность процесса клонирования, с помощью которого можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то возможно экспериментально изучить молекулярный механизм регуляции транскрипции этого гена и наработать такой белок в нужном количестве. Внедрение подобных механизмов в многотоннажное производство с целью получения продуктов с набором полезных характеристик является одной из главных целей генной инженерии и биотехнологии вообще. Например, если ввести в генотип почвенных бактерий гены нитрифицирующих бактерий, то почвенные бактерии смогут переводить молекулярный азот воздуха в связанный азот почвы. [c.496]

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Рис. 1.6. Схема эксперимента по клонированию фрагментов ДНК с помощью плазмид

Клонирование фрагментов ДНК от 100 т. н. п. и более осуществляют в специально сконструированных векторах ВАС и YA . [c.41]

Библиотека генома — набор клонированных фрагментов ДНК, содержащий весь геном. [c.458]

Клонирование фрагмента ДНК позволяет получить любое его количество из одной-единственной молекулы. (Клоном называется большое число клеток или молекул, идентичных исходной родительской клетке или молекуле). Клонирование ДНК возможно благодаря способности бактериальных плазмид и фагов продолжать нормально функционировать после встраивания в их геном дополнительных последовательностей ДНК. [c.236]

Клонирование фрагментов, полученных путем механического дробления, сопряжено с рядом технических трудностей в вектор легче встроить рестрикт. Однако сложность такого встраивания состоит в том, что сайты рестрикции могут находиться в неудобных местах, например в середине гена, который надо клонировать. Один из способов преодоления этой трудности состоит в использовании более чем одной рестриктазы, т.е. в повторении эксперимента с различными ферментами, сайты узнавания которых занимают разные положения. Но это требует дополнительного времени, и при работе с длинной последовательностью бывает сложно найти фермент, не разрезающий ее. [c.243]

Отдельные участки сателлитной ДНК могут быть встроены в плазмиды с целью клонирования. Трудность в этом случае состоит в том, что последовательности сателлитной ДНК иногда имеют тенденцию исчезать из химерных плазмид при рекомбинации в бактерии-хозяине. Однако при успешном клонировании можно однозначно определить нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента. Таким способом можно установить реальную нуклеотидную последовательность повторяющейся единицы или единиц, но при этом для определения характера различий, типичных для сателлитной ДНК в целом, необходимо располагать данными о большом числе таких индивидуальных последовательностей. [c.303]

У дрожжей точки начала репликации не относятся к семейству повторяющихся последовательностей. Вполне возможно, что много разных последовательностей способны обеспечивать функцию точки начала репликации. Уменьшая размер клонированных фрагментов, можно определить минимальную последовательность, необходимую для обеспечения ars-функции. Единственная область гомологии ars-элементов представлена канонической последовательностью из 11 п. н. (в каждом элементе может быть не больше трех замен). Обычно эти последовательности находятся в окружении А—Т-богатой ДНК. [c.404]

Клонированные фрагменты ядерной ДНК могут быть использованы в качестве радиоактивных зондов для изучения изменений в структуре хроматина, которыми сопровождается транскрипция соответствующих генов. Об изменениях в структуре хроматина в области интенсивно транскрибируемых последовательностей свидетельствует их повышенная чувствительность к расщеплению ДНКазой I. О способах обнаружения такого рода структурных изменений подробнее рассказывается в Дополнении 16.1. [c.220]

Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т.п.н., клонированного на фаговом векторе. Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент ДНК, радиоактивно меченный ( Н) с помощью ник-трансляции. Пред- [c.314]

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. соИ Rfi 5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, относящаяся к группе колициногенных плазмид Е. соИ. ol El реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благодаря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. соИ. [c.118]

Если перенести такие фрагменты на подложку и провести гибридизацию с клонированным фрагментом определенного участка генома, можно получить данные о структуре хроматина в этом участке. В некоторых наиболее упорядоченных участках хроматина лесенка продолжается вплоть до олигомера, содержащего 15 нуклеосом и выше. Однако в большинстве случаев эта лесенка смазывается значительно раньше, причем для транскрибируемых участков хроматина регулярность расположения нуклеосом значительно ниже, чем для неактивного хроматина. Длины олино-гуклеосомных фрагментов ДНК. кратны величине, называемой нуклеосом ным повтором. Размер нуклеосомного повтора изменяется от 165 п. о. у дрожжей до 200 и.о. у высших эукариот и достигает 240 п. о. в хроматине из спермы морского ежа. [c.243]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Рис. 6.1. Идентификация сильных регулируемых промоторов. В плазмиду встраивают ген-репортер без промотора. Хромосомную ДНК разрезают рестрицирующей эндонуклеазой Abel и встраивают фрагменты в плазмиду. Если ген-репортер эффективно экспрессируется, значит, клонированный фрагмент содержит функциональный промотор.

Если клетка трансформирована нереплици-рующейся плазмидой, несущей клонированный ген в середине клонированного фрагмента с хромосомным сайтом интеграции, то может произойти спаривание между гомологичными нуклеотидными последовательностями плазмиды и хозяйской ДНК (рис. 6.15, А) и далее интеграция в результате двойного кроссинговера, осуществляемого ферментами клетки-хозяина. Альтернативный вариант — интеграция всей плазмидной ДНК в хромосому хозяина в результате одиночного кроссинговера (на рисунке не показано). Интеграция всей плазмиды может произойти и в том случае, если клонированный [c.123]

Рис. 20.27. Прогулка по хромосоме . А. Зонд 1 гибридизуют с клонированным фрагментом ДНК длиной 40 т. п. н. После субклонирования и построения рестрикционной карты последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся, используют для создания зонда 2. Б. При помощи зонда 2 из библиотеки выбирают другой клон (отличный от клона 1) и используют последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся с ним, для создания зонда 3. Клоны 1 и 2 вместе составляют примерно 80 т. п. н. (за вычетом перекрывающегося участка - зонд

Как уже упоминалось, чаще всего в качестве матрицы для анализа используются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах. Для унификации анализа последовательности любых фрагментов, клонированных в составе данного фага-вектора, можно использовать одну и ту же затравку. Для этого затравка должна быть комплементврна ие клонированному фрагменту, а (- -)-цепи фага вектора в том ее месте, которое граничит с З -концом клонированной вставки (рис. 185). В качестве затравок чаще всего используются синтетические олиго- и дезоксирибонуклеотиды. Для исключения деградации затравки с 5 -конца в качестве ДНК-полимеразы применяется обычно фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. oli. [c.328]

Фермент используется в генной инженерии при клонировании фрагментов ДНК (см с. 433) и в анализе последовательности ДНК для введения метки по З -коицевым звеньям. [c.352]

Клонирование всего генома (в противоположность клонированию специфических фрагментов) часто называют шотган -экспериментами (shotgun experiment-метод дробовика). Для их осуществления весь геном разделяют на фрагменты удобного размера. Затем фрагменты встраивают в клонирующий вектор с образованием популяции химерных векторов. Набор таких клонированных фрагментов называют библиотекой генома. Библиотека, однажды полученная с помощью фагового или плазмидного вектора (чаще-фагового вектора, поскольку в таком виде легче хранить необходимые большие количества химерных ДНК), может храниться неограниченно долгое время и при появлении нового зонда быстро может быть использована для поиска специфического фрагмента. [c.243]

Число случайно полученных фрагментов, которые должны быть клонированы для того, чтобы обеспечить высокую вероятность наличия каждой последовательности генома хотя бы в одной химерной плазмиде, уменьшается с ростом размеров фрагмента и увеличивается с ростом размеров генома и желаемой вероятности. Для 99%-ной вероятности необходимо 1500 клонов с фрагментами ДНК Е. соИ для дрожжей размер библиотеки возрастает до 4600 клонов, для D. melanogaster-до 48 ООО и до 800 ООО-для млекопитающих. Все эти библиотеки клонированных фрагментов, где достигается такая ве- [c.244]

Путем уменьшения размера клонированного фрагмента удалось установить, что функциональная область ori содержит только 422 пары оснований. Наличие такого фрагмента в плазмиде гарантирует ее выживаемость. Следует отметить, однако, что число копий таких плазмид в клетке может достигать 20. Следовательно, они утратили некоторые свойства, которые ограничивают частоту инициационных событий. По-видимому, число копий и акт инициации репликации могут зависеть от различных последовательностей. [c.399]

Дополнительным подтверждением гомологии между онкогенами и последовательностями нормальных клеток служит и тот факт, что они, как правило, кодируют аналогичные белки. Например, онкоген вируса саркомы Рауса кодирует тирозин-специфичную киназу, обозначаемую ррбО . Этот белок представляет собой фосфопротеин молекулярной массы 60000. Такой же белок выделяется и из нормальных клеток цыпленка, хотя в этих клеттсах его количество в 100 раз меньше, чем в раковых. Использование клонированных фрагментов онкогенов в экспериментах по ДНК-гибридизации выявило гомологию между геном газ вируса саркомы Харви и геном из клеток карциномы мочевого [c.323]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование фрагментов: [c.173] [c.243] [c.173] [c.60] [c.62] [c.74] [c.91] [c.106] [c.113] [c.209] [c.324] [c.337] [c.373] [c.195] [c.211] [c.39] [c.297] [c.281] [c.154] [c.314] [c.232]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология