Отжиг с комплементарным полинуклеотидом

Метод плавления двойной спирали ДНК с последующим ее восстановлением из комплементарных одноцепочечных полинуклеотидных нитей нашел одно из своих наиболее интересных применений в систематике высших организмов. Основная идея, лежащая в основе такого использования, сводится к следующему чем больше одинаковых генов у двух организмов и, следовательно, чем больше у них одинаковых последовательностей оснований в ДНК-полинуклеотиде, тем ближе их родство. Следовательно, чтобы установить степень родства между организмом А и организмом В, необходимо только выделить ДНК из их клеток, нагреть ее, провести отжиг этой смеси ДНК и установить количество образовавшихся гибридных двойных спиралей, которые несут одну полинуклеотидную цепь, полученную от А, а другую — от В. Для осуществления таких экспериментов Боултон и Мак-Карти разработали простой метод определения и количественной оценки гибридных двойных спиралей ДНК. Для этой цели ДНК, экстрагированную из организма А, нагревают до 100 С и быстро охлаждают для разделения нативных молекул ДНК на отдельные полинуклеотидные цепи. Такие разделившиеся цепи добавляют к горячему раствору расплавленного агара, который затем быстро охлаждают. При затвердевании агара отдельные цепи ДНК оказываются неподвижно закрепленными в агаровом геле. Тем временем клетки организма В выращиваются в присутствии радиоактивного предшественника ДНК, такого, как ФО " или С-тимин. Радиоактивную ДНК экстрагируют затем из клеток В, разрывают механически на относительно короткие полинуклеотидные фрагменты, содержащие около 1000 нуклеотидов в длину, нагревают и быстро охлаждают для разделения двойных спиралей на отдельные цепи и затем добавляют к агару, в котором уже закреплены отдельные цепи ДНК из организма А. После этого агар нагревают до 60 °С и выдерживают при этой температуре в течение ночи. В этих условиях начинают образовываться двойные спирали, содержащие одну полинуклеотидную цепь из организма А, а другую— из организма В. Затем через агар пропускают солевой раствор, чтобы отмыть все типы В-поли-нуклеотидных цепей, не образовавших двойных спиралей с закрепленными в агаре А-полинуклеотидными цепями и, следовательно, не включившихся в агар. Определив включение радиоактивных В-цепей, устанавливают, какая доля меченой ДНК организма В может образовать двойные спирали и, следовательно, имеет одинаковые нуклеотидные последовательности с немеченой ДНК организма А. [c.183]

Последовательность искусственного гена разбивается на полинуклеотиды длиной 80-90 нуклеотидных звеньев. Они дополняются с 5 -и 3 -концов 18-членными последовательностями, комплементарными участкам векторной плазмиды, окружающим уникальный сайт рестрикции (например Bsml). Векторная плазмида линеаризуется по этому сайту и отжигается с полинуклеотидом. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е. соИ. Комплементарная синтетическому полинуклеотиду цепь синтезируется in vivo хозяйской ДНК-полимеразой Е. oli. [c.74]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология