Нуклеотидные последовательности звеньев

Рис. 5.9. Сборка синтетического гена из коротких олигонуклеотидов. Синтезируют отдельные олигонуклеотиды длиной от 20 до 60 звеньев каждый с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге из них образовалась двухцепочечная молекула. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4.

В природе синтез белков всегда направлен на формирование определенной первичной структуры и протекает в водных средах при обычных температурах в соответствии с универсальным генетическим кодом под влиянием специфических ферментов. Основная схема этого процесса в настоящее время уже известна. Всю генетическую информацию, обеспечивающую формирование определенной первичной структуры полипептидных цепей и макромолекул белка, несут важнейшие биополимеры, относящиеся к классу сложных полиэфиров, - нуклеиновые кислоты. Эта информация определяется последовательностью соединения друг с другом различных нуклеотидных оснований - звеньев этого полимера. [c.349]

В понятие первичной структуры нуклеиновых кислот наряду с нуклеотидным составом входит нуклеотидная последовательность, т. е. порядок чередования нуклеотидных звеньев. Общий подход к установлению последовательности нуклеотидных звеньев заключается в использовании блочного метода сначала полинуклеотидную цепь направленно расщепляют на более мелкие блоки (олигомеры) и в них определяют нуклеотидную последовательность. Такой анализ повторяют, используя другие расщепляющие агенты, делящие цепь на фрагменты в иных местах по сравнению с предыдущими приемами. В целом полинуклеотидную цепь расщепляют каждый раз на довольно короткие фрагменты. [c.444]

До самого последнего времени расшифровка нуклеотидных последовательностей ДНК представляла почти неразрешимую проблему не только из-за большого размера молекул, но также из-за отсутствия подходящих нуклеаз. Часто прибегали к транскрибированию участков ДНК с образованием РНК или же каким-либо образом встраивали определенные рибонуклеотиды в ДНК, чтобы использовать имеющиеся рибонуклеазы для частичного расщепления ДНК. Однако за последние несколько лет было открыто большое число высокоспецифичных рестриктаз. Они расщепляют двухцепочечную ДНК в определенных последовательностях, состоящих из четырех-шести оснований, и позволяют расчленить длинные молекулы на фрагменты, поддающиеся анализу. Для определения последовательностей в таких рестрикционных фрагментах бьши разработаны новые, очень мощные методы. Ключевым моментом в этих методах является возможность разделения (с помощью электрофореза) фрагментов ДНК, которые различаются по длине на один нуклеотид, в то время как сами фрагменты содержат до нескольких сотен звеньев это позволяет точно локализовать места химических или ферментативных расщеплений просто измерением длины получающихся фрагментов ДНК. Эти новые методы столь эффективны, что они за короткое время дали возможность получить информацию о последовательностях ДНК, превосходящую по объему все накопленные за десятилетия данные о последовательностях белков и РНК. [c.158]

Нуклеотидную последовательность специфических олигонуклеотидных зондов (длиной 20-40 звеньев) находят из данных об аминокислотной последовательности соответствующих белков. [c.85]

В связи с проблемой установления нуклеотидной последовательности в полинуклеотидах очень большой длины, подобных ДНК, большие перспективы имеют, по-видимому, методы, основанные на применении электронной микроскопии. Расстояние между основаниями в полинуклеотидной цепи денатурированной ДНК составляет около 7 А. Можно надеяться, что применение электронных микроскопов с достаточно высокой разрешающей способностью позволит непосредственно увидеть отдельные нуклеиновые основания в полинуклеотидной цепи и определить таким образом последовательность мономерных звеньев. Возможность реализации та- [c.82]

Окисление З -концевого нуклеозидного звена РНК и последующее расщепление прилегающей к нему фосфодиэфирной связи с выделением гетероциклического основания могут быть использованы для ступенчатого укорачивания цепи олиго- или полинуклеотидов (см. стр. 65). С помощью этого метода для ряда вирусных РНК удалось установить нуклеотидные последовательности, прилегающие к З -концу молекулы (см. стр. 81). [c.535]

Гель-электрофорез использовали для изучения нуклеотидной последовательности ДНК генома до тех пор, пока не были открыты рестриктазы. К настоящему времени выделены сотни таких ферментов, каждый из которых узнает специфическую нуклеотидную последовательность длиной от 2 до 8 пар оснований и расщепляет двухцепочечную молекулу ДНК лишь в этом участке [108]. Точки расщепления обеих цепей ДНК могут находиться либо на одинаковом расстоянии от одного из концов молекулы (т. е. располагаться строго напротив друг друга), либо быть смещены относительно друг друга на несколько звеньев. В первом случае образуются фрагменты с тупыми концами, содержащие только спаренные нуклеотидные остатки, а во втором — с липкими , которые представляют собой небольшие участки одноцепочечной ДНК. Используя рестриктазы различной специфичности, можно расщепить высокомолекулярную ДНК на отдельные фрагменты, размеры большинства из которых находятся в диапазоне, приемлемом для разделения этих фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле [107]. Таким способом были получены уникальные фрагменты ДНК генома, которые затем были встроены в рекомбинантные ДНК-векторы [109]. Этот раздел посвящен разделению таких фрагментов. [c.184]

Первичная структура нуклеиновых кислот определяется последовательностью нуклеотидных звеньев, связанных ковалентными связями в непрерывную цепь полинуклеотида. [c.442]

Существующие методы деградации более пригодны для изучения нуклеотидной последовательности РНК. Это обусловлено особенностями ее структуры, а именно наличием а-диольной группировки у Сг- и j-, что создает предпосылки для разработки методов, основанных на химической модификации этой группировки и последующем ступенчатом отщеплении концевых модифицированных звеньев цепи. С другой стороны, известны высокоспецифичные РНК-азы, позволяющие проводить избирательное расщепление РНК до олигонуклеотидов. В настоящее время [c.388]

Последовательность нуклеотидов и генетический код. Методы определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны еще в 50-х гг. Теоретически это относительно легкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу элементарных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований-гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда еще в 60-х г. был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько разных нуклеотидных триплетов. Следовательно, суждения о нуклеотидной последовательности, основанные на последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того, последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодирующих участков ДНК. В настоящее время разработаны методы непосредственного секвенирования ДНК [117]. Принцип состоит в следующем длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющих ее в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очередность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающиеся концы идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности перекрывающихся фрагментов, образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно [c.131]

Вторая особенность электрофореза нуклеиновых кислот и их фрагментов — очень широкий диапазон молекулярных масс. Например, при определении нуклеотидной последовательности ДНК или РНК приходится разделять полученные при их гидролизе олигонуклеотиды, содержащие единицы и десятки мономерных звеньев, т. е. молекулы с массами от тысячи до нескольких сотен тысяч дальтон, а это — тот же диапазон, что для белков и пептидов. Естественно, что электрофорез при этом ведут в ПААГ с концентрацией от 5 до 20%, в зависимости от конкретной задачи. С другой стороны, электрофорез можно успешно использовать для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и даже целых молекул ДНК или РНК вирусов. В этих случаях электрофорез ведут в гелях агарозы. [c.121]

Первым достижением при использовании более быстрого метода определения последовательности [70], чем метод Холли, было установление нуклеотидной последовательности 120 мономерных звеньев 5S РНК из Е. oli. Свойства ее растворов указывают на наличие структуры высшего порядка с некоторой жесткостью и с большим числом спаренных оснований. Однако ее нуклеотидная последовательность позволяет при свободном выборе построить слишком много вторичных структур, в этом случае для их выбора был применен анализ РНК методом температурно-варьируемой ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Данные, полученные Этим методом [71], отдают предпочтение структуре, содержащей [c.61]

С открытием интрон-экзонного строения генов, характерного для эукариотических клеток, начался новый этап исследований на пути реализации генетической информации. Транскрипция гена, состоящего из чередующихся кодирующих и некодирующих нуклеотидных последовательностей, обеспечивала полное его копирование и приводила к синтезу РНК-предшественника. Поэтому было высказано предположение о существовании между транскрипцией и трансляцией еще одного важного звена-образования пригодной для трансляции зрелой молекулы мРНК. Этот этап получил название процессинга, или созревания, мРНК. [c.490]

Важным передаточным звеном при переводе генетической информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот являются рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые синтезируются на определенных участках ДНК как на матрицах в соответствии с их нуклеотидной последовательностью. РНК - это линейная полинуклео-тидная молекула, отличающаяся от ДНК в двух отнощениях. Во-первых, моносахаридом в РНК является рибоза, содержащая не одну, а две гидроксильные группы они связаны с 2 - и 3 -атомами углерода. Во-вторых, одним из четырех оснований в РНК является урацил (11), занимающий место тимина. Большинство молекул РНК одноцепочечные, хотя часто в них имеются вза- [c.34]

Хотя нуклеиновые кислоты содержат всего четыре типа мономерных звеньев, множество мыслимых нуклеотидных последовательностей превосходит таковое для белков вследствие существенно большей длины полинуклеотидных цепей. Так, сравнительно небольшая ДНК митохондрий представляет собой две по-линуклеотидньге цепи, каждая из которых содержит до нескольких десятков тысяч связанных между собой нуклеотидов. В хромосоме Е.соИ число нуклеотидов в каждой из двух полинуклеотидных цепей составляет около четырех миллионов. [c.53]

В щелочных условиях реакции с гидразином и гидроксиламииом приводят к расщеплению гетероциклическ11Х колец пиримидинов (см. с. 325), практически не затрагивая пуриновых оснований. Реакция ДНК с гидразином, сопровождающаяся расщеплением по пиримидиновым звеньям, используется при определении нуклеотидной последовательности ДНК в методе Максама — Гилберта. [c.386]

Два больших открытия, сделанные в 1953 г., ознаменовали наступление новой эры в биохимии. В этом году Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик в Кембридже (Англия) создали модель структуры ДНК (двойную спираль) и высказали предположение о структурной основе точной репликации ДНК. В этом предположении, по существу (хотя и не в явной форме), была выражена идея о том, что последовательность нуклеотидных звеньев ДНК содержит в себе закодированную генетическую информацию. В том же году Фредерик Сэнгер, работавший в Кембридже в той же лаборатории, расшифровал последовательность аминокислот в полипептидных цепях гормона инсулина. Это достижение само по себе имело большое значение, так как в течение долгого времени считалось, что определение аминокислотной последовательности полипептида представляет собой совершенно безнадежную по трудности задачу. Но, кроме того, результаты, полученные Сэнгером, практически одновременно с появлением гипотезы Уотсона-Крика, тоже наводили на мысль о существовании какой-то связи между нуклеотидной последовательностью ДНК и аминокислотной последовательностью белков. В следующее десятилети Ь эта идея привела к расшифровке всех содержащихся в ДНК и РНК нуклеотидных кодовых слов, которые однозначно определяют аминокислотную последовательность белковых молекул. [c.146]

Теперь точно так же поступают с тремя другими наборами фрагментов, полученными в результате специфического выщепления соответственно остатков G, А и Т из исходного олигонуклеотида (рис. 1). На схеме мы видим, что меченые фрагменты, полученные при выщеплении остатков G, движутся со скоростью, соответствующей олигонуклеотидам длиной в 5 и 9 нуклеотидных звеньев таким образом, остатки 6 и 10 в исходном олигонуклеотиде должны быть G. Из третьего набора фрагментов, полученного удалением А, следует, что в положениях 2, 5 и 9 были остатки А четвертый набор фрагментов, полученный выщеплением остатка Т, указывает на присутствие остатков Т в положениях 3 и 8. В нижней части рис. 1 дана нуклеотидная последовательность, установленная с помошью этой простой процедуры и некоторых рассуждений. Этим методом часто быстрее чем за 2 дня может быть определена нуклеотидная последовательность олигонуклеотидов, содержащих 200 и даже большее число остатков. [c.889]

РИС. 2-37. Двумерная нуклеотидная карта, полученная в результате частичного гидролиза Р-олигонуклеотида, отщепленного от кольцевой копии ДНК, синтезированной иа цепи глобниовой мРНК (гл. 15, разд. Ж.4). Олигонуклеотид обрабатывали экзонуклеазой из змеиного яда (фосфодиэстера-зой, табл. 2-11), отщепляющей нуклеотиды последовательно с З -конца. Самое верхнее пятно соответствует нуклеотиду неизвестного состава каждое следующее расположенное ниже пятно содержит иа одно нуклеотидное звено больше. По относительной подвижности промежуточных продуктов (см. текст) была восстановлена последовательность (5 )- [c.172]

Продукты окисления первичной спиртовой группы в олигодезоксинуклеотидах достаточно легко претерпевают р-элиминацию с расщеплением фосфодиэфирной связи(см. стр. 66) эта реакция была предложена для определения нуклеотидной последовательности в дезоксиолигонуклеотидах, примыкающей к З -концу. Еще легче протекает расщепление в олигодезоксинуклеотидах, содержащих на 5 -конце цепи остаток З -кетонуклеозида. В этом случае образование основания и олигонуклеотида, содержащего на одно звено меньше, чем исходный, происходит уже в процессе окисления [c.531]

Щелочной гидролиз РНК до мононуклеотидов, хотя он и является одним из самых распространенных методов определения нуклеотидного состава РНК и часто применяется при установлении нуклеотидной последовательности и определении концевых звеньев в олигонуклеотидах (см. стр. 45), как аналитический метод имеет ряд существенных недостатков. В процессе щелочного гидролиза РНК происходит существенное дезаминирование производных цитозина и в еще большей степени З-Н-метилцитозина, разрушение производных 5,6-дигидроурацила (см. стр. 456), а также 7-М-метилпуринов и l-N-метилгипоксантина (см. стр. 440 и 442), перегруппировка производных l-N-метиладенина в б-экзо-Ы-метиладенины (см. стр. 450). Поэтому для анализа содержания этих соединений в составе РНК щелочной гидролиз непригоден. [c.559]

Существует дйа метода анализа, результаты которых указывают на последовательность оснований в молекулах ДНК- Однако сами по себе они не обеспечивают полного определения нуклеотидной последовательности в ДНК. Один из этих методов — анализ ближайших с о с е д е й, а другой — анализ пиримидиновых блоков ДНК. Применяя второй метод, ДНК обрабатывают разбавленной неорганической кислотой. В этих условиях отщепляются пуриновые основания, а на их местах в полимере остаются дезоксирибозофосфатные звенья. Что же касается пиримидиновых нуклеотидов, то они остаются на исходных местах в молекуле ДНК. [c.37]

Анализ нуклеотидной последовательности РНК — система методических приемов, позволяющих установить первичную структуру РНК, т. е. порядок чередования нуклеотидных звеньев в полинуклеотидной цепи ГОК. В этой области современная биохимия располагает значительными успехами — установлена последовательность нуклеотидов многих тРНК и 5S-PHK. Именно эти РНК оказались весьма удобны.ми объектами для подобного рода исследований. Их молекулы представляют собой сравнительно короткие полинуклеотидные цепи и легко выделяются в виде иидивидуаль-ных фракций. [c.38]

РНК, нуклеотидная последовательность — порядок, в котором нуклеотидные звенья расположены в полинуклеотидной цепи. От этого порядка зависит ее первичное строение. Определение нуклеотидной последовательности — один из важных вопросов химии нуклеиновых кислот. В последнее время расшифрована первичная структура тРНК нескольких 58-РНК. [c.79]

Основные трудности в определении последовательности оснований в рибосомной, информационной и В1фусной РНК возникают вследствие большого размера их молекул. Длина цепей этих молекул колеблется от 1300 звеньев у РНК вируса-сателлита вируса некроза табака, 1500 звеньев у 16 рибосомной РНК до 6000 и более звеньев у вирусных РНК. Если это сопоставить с примерно 75 звеньями у тРНК и 120 звеньями у 55 РНК, то становится ясно, что определение нуклеотидных последовательностей у таких больших молекул по сравнению с более короткими в 10-20 раз более трудоемко. Составление полных и точных нуклеотидных перечней на основании гидролиза высокомолекулярных РНК специфическими нуклеазами даже при помоши наиболее эффективного в насто ш1ее время метода перекрывающихся последовательностей является сложнейшей задачей. [c.150]

Синтез меченой нуклеотидной последовательности длиной около 150 звеньев при 37 С должен протекать за 5 мин. Чтобы удобнее контролировать реакцию, темпера уру снижали до 20 С и концентрацию нуклеотидов уменьшали до 0,8-0,1 тМ. В результате этого скорость полимеризации уменьшалась приблизительно до 5 нуклеотадов в 1 с. После добавления смеси трех нуклеозидтрифосфатов линейное включение метки происходило сразу же, причем в течение следующей минуты не наблюдалось инициации новой цепи. [c.184]

Разделив продукты исчерпывающего или частичного гидролиза РНК с помощью рибонуклеазы, структуру большинства РНК устанавливают путем сравнения нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов. Каждый индивидуальный олнгорибонуклеотид подвергают частичному гидролизу с помощью менее специфичной рибонуклеазы (например, с помощью рибонуклеазы Тг), которая расщепляет все фосфоди-эфирные связи. Реакцию проводят в таких условиях, чтобы получить набор фрагментов, различающихся по длине на один нуклеотидный остаток. С помощью двумерной гомохроматографии на пластинках с DEAE-целлюлозой разделяют эти продукты и по характеристическому изменению подвижности укороченных на одно звено фрагментов судят о природе нуклеотидного остатка, который в исходном олигорибонуклеотиде занимал соответствующее положение. Таким образом можно прочитать всю хроматограмму и установить полную нуклеотидную последовательность данного олигорибонуклеотида [5, 128]. [c.190]

Знание нуклеотидных последовательностей создает необходимые предпосылки для использования многих экспериментальных методов. Эти данные нужны для успешного применения метода химической модификации с целью исследования классов доступных и недоступных для реакции звеньев (см. обсуждение третичной структуры тРНК ниже в этой главе). Информация о последовательности необходима для анализа данных, получаемых с помощью различных химических или физических зондов, которые позволяют оценивать расстояние между определенными звеньями, участвующими, например, в образовании внутримолекулярных сшивок. Она может использоваться также в сочетании со спектроскопическими или другими физическими данными для того, чтобы попытаться установить, какие из предполагаемых спиральных участков присутствуют в нативной молекуле. Эти методы рассмотрены подробно в гл. 24. [c.162]

Проблему образования димеров в РЕР-ПЦР пытаются решать с помощью варианта метода, получившего название ПЦР со случайными мечеными праймерами (tagged random primer P R - T-P R) [319]. В этом случае при амплификации использовали смесь всевозможных 9-звенных олигонуклеотидных праймеров, каждый из которых содержал 5 -концевую метку в виде постоянной 17-нуклеотидной последовательности [c.240]

Центральным элементом метода секвенирования ДНК-гибридиза-цией служит олигонуклеотидная матрица, или микрочип, на котором в строго определенных местах фиксированы конкретные олигонуклеотиды с известной последовательностью. Если для использования данного метода в диагностических целях можно ограничиться лишь несколькими конкретными олигонуклеотидами, то для секвенирования de novo необходимо иметь полный набор олигонуклеотидов, состоящий из 4 вариантов. При этом считается, что длина фрагмента ДНК, который можно просеквенировать в одном эксперименте, приблизительно равна квадратному корню из числа всех возможных олигонуклеотидов в данном наборе [Southem et al., 1992]. В работе Певзнера и соавт. [Певзнер и др., 1991] приведено приблизительное соотношение длины применяемых олигонуклеотидов в матрице и протяженности фрагмента ДНК, нуклеотидная последовательность которого может быть однозначно установлена. Так, например, около 2,5 тыс. нуклеотидов теоретически можно прочитать в одном эксперименте с помощью полного набора олигонуклеотидов, состоящих из 12 звеньев. Однако сама матрица при этом будет состоять из огромного числа 16 777 216 вариантов. Набор из 262 144 9-мерных олигонуклеотидов, хотя теоретически и позволяет однозначно определять нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК протяженностью около 500 нуклеотидов, в настоящее время слишком велик для изготовления подобной матрицы. Достаточно оптимальной можно считать матрицу с длиной олигонуклеотидов, равной 8 звеньям, что составляет всего 65 536 всех возможных вариантов таких молекул, изготовление которой также весьма не простой процесс. Приведенная на рис. 13.1 несколько упрощенная схема иллю- [c.403]

С развитием новых технологий молекулярных исследований, основанных на быстрых методах работы с ДНК (клонировании фрагментов ДНК генноинженерными способами и с помощью полимеразной реакции, автоматизированном секвенировании), с введением в практику молекулярногенетических исследований компьютерных технологий сравнительного анализа строения гено.мов представителей разных систематических групп, с развитием техники направленного воздействия на генетический аппарат клетки и организма в целом и возможности создания искусственных ферментов по нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК темпы развития молекулярной генетики обрели стремительный характер и привели к возникновению в конце 80-х гг. международной программы Геном человека . Этот глобальный проект предполагает к 2005 г. завершить определение полной последовательности всех трех миллиардов нуклеотидных звеньев, составляющих геном человека. Принятие такой программы означает, что характер развития молекулярной биологии достиг совершенно нового уровня. Произошедший качественный скачок в технологии позволяет решать принципиально новые задачи. [c.72]

Более сложной проблемой является синтез гетероолигонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидных звеньев. В этом случае задача состоит в последовательном наращивании определенных звеньев на каждом этапе наращивания молекулярной цепи исходные соединения должны быть монофункциональны, что исключает гомополиконденсацию. [c.366]

Во-вторых, для живой клетки такое огромное разнообразие возможных структур, включающих считанные единицы мономерных остатков, означает гигантские информационные возможности, совершенно несопоставимые по мощности с возможностями такого классического информационного материала, как последовательность нуклеотидных звеньев в нуклеиновых кислотах. Вспомним трехбуквенный генетический код позволяет построить из четырех основных природных нуклеотидов всего 64 слова , тогда как из восьми гексоз (а разнообразие природных моносахаридов гораздо больше) уже можно составить 1 645 056 трисахаридных слов . [c.25]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология