Агаровый гель, приготовление

Однако приготовление агарового геля является более трудоемкой процедурой, чем соответствующие операции с бумагой, о несомненно ограничивает широкое использование электрофореза в агаре. Другое затруднение связано с необходимостью подбора подходящего типа агара, так как качество агара влияет на электро- [c.13]

Приготовление агарового геля [c.226]

Приготовление агаровой 1,5 %-ный агаровый гель готовят на указанном выше буферном растворе (очистка агара и приготовление геля описаны на стр. 127). [c.138]

При иммуноэлектрофорезе сначала разделяют смесь антигенов действием электрического поля (антигены с разной скоростью мигрируют в агаровом геле, приготовленном на соответствующем буфере). Затем заполняют антисывороткой траншею, идущую параллельно движению антигенов под действием электрофореза, и проводят иммунодиффузию. [c.367]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Приготовление лунок. Лунки в слое агарового геля для внесения исследуемых образцов можно сделать двумя способами [c.131]

ТОЧНЫХ белков — 0,2 мл сыворотки крови), подогревают до 40°С и смешивают с 0,8 млЗ%-ного расплавленного агара, приготовленного на дистиллированной воде и охлажденного до 40°С. Полученную смесь вносят в лунку для исследуемого образца на агаровой пластинке. Оставшийся свободный объем лунки заполняют 1,5%-ным агаровым гелем в буферном растворе. При заполнении лунки следует избегать образования пузырьков воздуха. [c.139]

Приготовление слоя агарового геля. Сухие предметные стекла помещают на горизонтальную поверхность (см. стр. 138) и с помощью пипетки с достаточно широким выходным отверстием наливают на поверхность каждого стекла 2 мл 1,5%-ного расплавленного агара, приготовленного на буферном растворе (об очистке агара и приготовлении геля см. на стр. 127). Необходимо добиться того, чтобы слой агарового геля был равномерным, покрывал всю поверхность стекла и не содержал пузырьков воздуха. Как только агар затвердеет, пластинки переносят во влажную камеру и хранят в холодильнике. Чаще всего агаровые пластинки готовят за 24 ч до постановки опыта. [c.142]

Меркурометрическое определение. При потенциометрическом определении хлорид-ионов в качестве титранта применяют также соли ртути(1). Титрование чаще всего проводят с индикаторным электродом из металлической ртути и каломельным электродом сравнения [383—385]. В работе [383] описан некомпенсационный метод потенциометрического определения хлорид-ионов, в котором индикаторным электродом служит амальгамированная серебряная проволока. Окончание осаждения хлорид-ионов ионами ртути(1) наступает всегда при потенциале +330 мв. К индикаторному электроду для упрощения титрования подбирался стандартный электрод с потенциалом + 330 мв, который представляет собой спираль из серебряной проволоки, погруженную в пасту из чистого хромата серебра. Паста готовится растиранием Aga rO с агаровым гелем, приготовленным на 10—12%-ном растворе KNOg. Потенциал такого электрода по отношению к насыщенному каломельному электроду составляет +327 мв, с ним можно титровать х.торид-ионы по гальванометру до 0-потенциала. Титрование возможно в широком диапазоне концентраций. [c.97]

Приготовление лунок для исследуемого антигена. При помощи подходящего инструмента (см. стр. 131) в агаровом геле вырезают лунки для антигена диаметром 2,4 мм, расположенные на расстоянии 12 мм друг от друга. Обычно на углах пластинки поверхность агара получается недостаточно ровной и образующиеся кольца преципитации не имеют правильных очертаний, поэтому четыре угловых лунки оставляют пустыми. [c.159]

Заполнение лунок. Часть лунок в агаровом геле заполняют капиллярной пипеткой заранее приготовленными растворами белка известной концентрации в соответствующих разведениях. В оставшиеся лунки наливают исследуемые образцы белковых смесей, например сыворотки крови. Следует тщательно следить за тем, чтобы во всех лунках был налит одинаковый объем растворов, заполняющий их точно до краев. После этого агаровую пластинку помещают во влажную камеру и на 24 ч оставляют в холодильнике. [c.159]

Флаконы из пирекса (50 мл) с крышками (или универсальные стеклянные флаконы на 20 мл) для приготовленного агарового геля. [c.199]

Агаровый гель, содержащий все необходимые ингредиенты для выявления кислой а-глюкозидазы, готовят смешиванием растворов А и Б в отношении 3- 1. Для приготовления раствора А в термостойкую пробирку помещают 160 мг агар-агара, 40 мг мальтозы или 160 мг амилопектина и 6 мл 0,4 М фосфатного буфера (pH 6,0). Смесь кипятят на водяной бане в течение 20— 30 мин до образования гомогенного раствора. Раствор Б готовят из глюкозооксидазы, ФМС и Нитро СТ, растворяя их в 0,4 М фосфатном буфере (pH 6,0). 2 мл раствора Б содержит 1,6 мг глюкозооксидазы, 1,2 мг ФМС и 3,2 мг Нитро СТ. После охлаждения раствора А до 55--60°С к нему добавляют раствор Б и образовавшуюся смесь быстра наносят на горизонтально установленную стеклянную пластинку (при размере пластинки 6X9 см требуется около 8 мл смеси растворов А и Б). Для лучшего затвердевания агарового геля пластинки с нанесенным слоем выдерживают 10—15 мин при 4°С. Так как красители обладают способностью к фотоокислению, раствор Б и готовые пластинки не должны подвергаться длительному воздействию света. [c.111]

Для приготовления агаровых пластинок используют предметные стекла. Предварительно их обезжиривают, тщательно промывают водой и высушивают. Стекла нумеруют, укладывают на строго горизонтальную поверхность и на каждое осторожно наливают пипеткой с широким концом 4 мл агара. Пузырьки воздуха в агаре необходимо вывести пипеткой на края стекла. Когда агар застынет и образуется твердый гель, в нем посередине вырезают лунку (щель) для нанесения исследуемого раствора. Приготовленные пластинки укладывают в электрофоретическую камеру. Агаровое плато соединяют с буферным раствором бумажными мостиками из фильтровальной бумаги. В щель каждой пластинки вводят сыворотку крови, предварительно разведенную буферным раствором. На электрофореграмму наносят около 100—300 мкг белка в объеме 0,01 мл. Прибор подключают к источнику тока. Медленно повышая напряжение, доводят силу тока до 20—25 мА (напряжение 200—300 В). Электрофорез проводят в течение 3—4 ч. [c.93]

Большое распространение получил электрофорез в тонких слоях для разделения высокомолекулярных веществ на различных носителях, особенно на агаровом, крахмальном и полиакриламидном гелях. Благодаря замечательной разделительной способности этот метод нашел применение прежде всего в клинической биохимии. Напомним, что в подавляющем большинстве случаев разделение с помощью этого метода осуществляется на носителях, приготовленных в форме геля. Опыт, накопленный в области хроматографии в тонких слоях, показал, однако, что для разделения некоторых групп веществ, в первую очередь низкомолекулярных, можно с успехом применять и суспензии некоторых сорбентов. [c.160]

Солевой мостик обеспечивает контакт между электродом сравнения и исследуемым раствором или соединяет два раствора таким образом, чтобы свести до минимума диф-фузионный потенциал (см.). Он представляет собой перевернутую U-образную трубку, оба конца которой закрыты полупроницаемыми пробками из пористого стекла или туго свернутой фильтровальной бумагой или асбестом. Трубки заполняют требуемым раствором и хранят солевой мостик в сосуде с тем же раствором (ответвлениями вниз). Приготовленные таким образом солевые мостики имеют преимущества перед мостиками, изготовленными из агар-агара, так как их свойства не меняются во времени и они не подвержены синерезису или усадке геля. Однако в тех случаях, когда желают свести до минимума загрязнение исследуемого раствора раствором в солевом мостике, следует использовать агар-агаровый мостик. [c.184]

Электрофорез проводится на стеклянных пластинках с нанесенным тонким слоем агарового геля, приготовленного на буферном растворе при pH 8,6. В геле ближе к одному краю пластинки по одной линии высекают гнездо и очень аккуратно вносят в него 0,1 мл раствора исследуемой смеси белков. После нанесения исследуемого раствора на оба края пластинки параллельно стартовой линии кладут фильтровальные бумажки, покрытые агаром. Эти бумажки служат соединительными мостиками, соединяющими агар на пластинке с буфе- [c.126]

Появление сгустков в агаровом геле, приготовленном из прозрачного расплавленного агара. Средн причин этого явления— незначительное понижение температуры в водяной бане, слишком медленное приготовление агарового слоя в чашке Петри, слишком долгое хранение взвесн клеток на льду нли слишком короткая инкубация смеси прн комнатной температуре перед внесением расплавленного агара. Чтобы устранить некоторые нз этих причин, следует готовить смесь в пробирках для гемолиза длиной не более 4—5 см. Нужно избегать иегомо-гениого затвердения агарового геля, так как мелкие преципитаты могут имитировать зоны гемолиза. [c.224]

Подобно крахмальному и акриламидному агаровый гель является очень мягким носителем в отличие от электрофореза на бумаге при нем не происходит инактивации белков, что позволяет определять активность отдельных фракций бeлкОДJieпo peд твeннo в геле после проведения электрофореза. Приготовление агарового геля значительно проще, чем крахмального или полиакриламидного, продолжительность электрофореза составляет I—4 ч. [c.92]

Приготовление агарового геля. Перед использованием отмытого агара в нем определяют содержание сухого вещества. Для этого, тщательно взвесив чашку Петри, в нее наливают 10 мл расплавленного агара. После затвердения агар высушивают в сушильном шкафу при 100°С в течение примерно 12 ч. После охлаждения чашку Петри вновь взвешивают и вычисляют концентрацию агара в отмытом геле. (Если, например, чашка Петри до внесения 10 мл агара весила 50,0 г, а после высушивания в ней агара весит 50,5 г, то, следовательно, внесенный раствор агара имел концентрацию 5%.) Зная эту величину, отмытый агар расплавляют и 0,9%-ным раствором НаС1 доводят до нужной концентрации, прибавив в качестве консерванта 0,01 % мертиолата. [c.128]

Приготовление агаровой пластинки. Обычно реакцию ставят в плоском слое агарового геля, затвердевшего на дне чашки Петри. Сначала внутреннюю поверхность чашки Петри покрывают агаровой пленкой. Для этого ее наполняют 0,1 %-ным расплавленным агаром, затем сразу же агар выливают, а чашки переносят в эксикатор для полного высушивания. Другой вариант подобной процедуры состоит в том, что покрывают дно чашки Петри слоем 1%-ного расплавленного агара толщиной примерно 1 мм. В качестве консерванта в агар следует добавить мертиолат. [c.131]

В подготовленные чашки Петри наливают расплавленный в физиологическом растворе 1 %-ный агар, содержащий 0,1% мертиолата, таким образом, чтобы получился слой толщиной 3—4 мм. В приготовленном слое агарового геля делают лунки для внесения исследуемых образцов. [c.131]

Приготовление агаровой пластинки. На стеклянную пластинку размером 10 х 16 см наносят 40 мл расплавленного 1,5%-ного агара в вероналовом буферном растворе pH 8,2. Затвердевший слой агарового геля разрезают в продольном направлении таким образом, чтобы после удаления лишних участков геля на стекле осталась только полоска шириной 15 мм. Со стороны катода на расстоянии одной трети длины этой полоски геля и на равном расстоянии от ее краев делают лунку для внесения исследуемого образца [c.151]

Приготовление пластинки агарового геля. 1 %-ный расплавленный агар наливают на дно чашки Петри (см. стр. 131). В затвердевшем агаровом геле при помощи пробойника для пробок или иного подходящего для этой цели инструмента (фиг. 34) делают лунки для исследуемого антигена и антисыворотки, как описано на стр. 131. Центральная лунка в диаметре должна примерно в 4 раза превышать расположенные на равном расстоянии от нее периферические лунки (12—16 п З-е-4 нм соотвехетвеяно). Две соседнйё периферические лунки должны агстоятн -друг от друга дальше, чем от центральной лунки. [c.157]

Твердые культуры относительно свободны от мак-ромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов, поскольку для их растворения необходимы значительно большие объемы среды. Следовательно, культуры, выращенные на твердой среде, особенно полезны для приготовления антигенов или для других целей, когда важна чистота клеточной суспензии. [c.363]

Агаровый или агарозный гель является наиболее подходящей средой для иммунодиффузии, В классическом варианте иммуноэлектрофореза и электрофорез, и иммунодиффузию осуществляют в одном и том же геле. Однако во многих случаях иммунодиффузию приходится проводить уже после того, как макромолекулы были разделены в другой среде, менее подходящей для иммунодиффузии. Паулик [1027] еще в 1852 г. применил иммунодиффузию для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза на бумаге. Хотя иммунодиффузию можно осуществлять и на ацетате целлюлозы (см. ниже), Кон [695] предложил переносить антигены с ацетата целлюлозы в агаровый гель вместо того, чтобы проводить весь иммуноэлектрофо-ретический анализ на ацетате целлюлозы. Пленку из ацетата целлюлозы, на которой антигены подвергали электрофорезу, разрезают на две половинки одну из них окрашивают, а из другой вырезают полоску шириной 1 см (на расстоянии 1 см от центральной линии) и помещают ее на поверхность заранее приготовленного агарового геля, следя за тем, чтобы под ней не образовывались пузырьки воздуха. Можно также быстро окрасить одну половинку полоски, а вторую разрезать на кусочки, так чтобы каждый из них содержал отдельную электрофоретическую фракцию. Эти кусочки пленки помещают на поверхность агарового геля, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Пропитанные соответствующей антисывороткой полоски фильтровальной бумаги шириной 2 мм кладут на гель параллельно кусочкам пленки и на оптимальном расстоянии от них. Это расстояние определяется теми же факторами, что и в случае иммуноэлектрофореза в агаровом геле. После завершения иммунодиффузии с поверхности геля удаляют полоски бумаги и кусочки пленки, а затем фотографируют полученную картину преципитации. Для приготовления стабильных препаратов гель высушивают и окрашивают по методике, предназначенной для иммуноэлектрофореграмм в агаре. Удаление лишних белков перед высушива1нием геля, как правило, не является обязательным. [c.243]

В качестве индикаторных клеток лучше использовать эритроциты, выдержанные в течение недели в растворе Олсвера, поскольку свежие эритроциты менее чувствительны к иммунному гемолизу. Перед приготовлением суспензии эритроциты трижды отмывают, центрифугируя по 10 мин при 2500 g при комнатной температуре. Затем клетки ресуспендируют в. ЗФР или СР до концентрации 20о/о (по объему) для работы в агаровом геле и 8—10% —для методики Каннингема. [c.290]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология