Секвенирование ДНК посредством гибридизации

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ПОСРЕДСТВОМ ГИБРИДИЗАЦИИ [c.400]

Главным недостатком этого варианта секвенирования ДНК посредством гибридизации, известного также как формат 1, является необхо- [c.401]

Как будет видно из дальнейшего изложения, в процессе продолжающейся разработки метода секвенирования ДНК посредством гибридизации предлагались различные варианты модификации олигонуклеотидов как иммобилизованных в матрице, так и образования на их основе за счет стэкинг-взаимодействий некоего гибридизационного комплекса с участием более коротких олигонуклеотидов, как несущих, так и не несущих метку. [c.404]

Одной из серьезных проблем, присущих секвенированию ДНК посредством гибридизации, является разная температура диссоциации для [c.406]

Продолжающийся поиск альтернативных возможностей определения нуклеотидной последовательности ДНК привел к разработке принципиально нового метода секвенирования ДНК посредством гибридизации. В его основу было положено представление, что вся последовательность ДНК состоит из коротких подпоследовательностей. Знание порядка нуклеотидов в них, а также расположение этих подпоследовательностей друг относительно друга позволяют реконструировать весь исследуемый фрагмент ДНК. Принцип определения нуклеотидной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК этим методом основан на образовании Уотсон-Криковских пар в результате проведения этапа гибридизации фрагмента ДНК с набором олигонуклеотидных зондов. Анализ характера гибридизации конкретных олигонуклеотидов позволяет провести реконструкцию секвенируемого фрагмента ДНК. [c.400]

Рис. 13.1. Реконструирование нуклеотидной последовательности с помощью метода секвенирования ДНК посредством гибридизации А - отдельные ячейки олигонуклеотидной матрицы, содержащие различные октануклеотиды (подчеркивание символизирует их фиксацию на подложке), с произошедшей там гибридизацией с исследуемым фрагментом ДНК (вертикальные черточки изображают связи между комплементарными олигонуклеотидами, выделенными жирным шрифтом) Б - реконструированная часть нуклеотидной последовательности секвенируемого

Сам размер олигонуклеотидной матрицы, или микрочипа, за эти годы изменился также весьма существенно. Так, первые конструкции изготавливались вручную, механически удаляя часть полимеризованно-го геля с целью получения квадратов со сторонами в 200 мкм, разделенных полосками чистого стекла шириной 300 мкм [Храпко и др., 1991]. Толщина гелевого слоя составляла 30 мкм. Совершенствование подобных чипов для процесса секвенирования ДНК посредством гибридизации привело к созданию ячеек толщиной 20 мкм и размером 40x40 мкм, [c.405]

Выявление с помощью ДНК-лигазы и ДНК-полимеразы подобных неспаренных нуклеотидов (пары G T и G A) в образовавшихся дуплексах при секвенировании ДНК посредством гибридизации, контролируемое путем подсчета радиоактивности, было предпринято в модельном эксперименте другими авторами [Broude et al., 1994]. Под действием ДНК-лигазы проводилось лигирование встык отожженой мишени на выступающем конце двуцепочечного олигонуклеотида, а ДНК-полимераза вызывала удлинение образовавшегося в результате отжига углубленного З -конца. Этот подход был основан на известном факте худшего узнавания подобных конструкций данными ферментами, однако полученные ими данные вряд ли могут быть прямо проецированы на более обычный вариант секвенирования гибридизацией, поскольку здесь в качестве твердой фазы служили магнитные частицы, покрытые стрептавидином, а один из олигонуклеотидов содержал молекулу биотина. Более того, одноцепочечный участок двух комплементарных друг другу олигонуклеотидов, доступный для гибридизации с мишенью, был представлен всего 5 нуклеотидами, (Такое внимание к этой работе вызвано тем, что она будет упомянута еще в конце данной главы,) [c.407]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология