Нуклеотиды и короткие олигонуклеотиды

НУКЛЕОТИДЫ И КОРОТКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ [c.319]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Для того чтобы могло произойти лигирование двух экзонов после расщепления цепи при участии гуанозина, два экзон-интронных сочленения должны сблизиться. Такому сближению способствует изгибание интрона, при котором места двух сочленений оказываются расположенными поблизости один от другого, по-видимому, около сайта связывания гуанозина. Можно предположить, что интрон содержит последовательность, которая способна спариваться с последовательностями экзона в местах двух сочленений (рис. 8.80). Наличие такой внутренней направляющей последовательности могло бы создать условия для реакции З -гидроксильной группы, образовавшейся при расщеплении 5 -экзон-ин-тронного сочленения, с фосфатной группой, находящейся в З -сайте сплайсинга. Этот сайт образуют остаток G, которым заканчивается интрон, и соседние нуклеотиды. В высвободившемся линейном ин-троне происходят конформационные изменения, которые, как полагают, облегчают циклизацию этого элемента, сопровождающуюся отщеплением коротких олигонуклеотидов (рис. 8.81). [c.109]

Небольшие делеции в окрестностях сайтов рестрикции можно получать быстрее удалением липких концов линеаризованной плазмидной ДНК после рестрикции с последующим замыканием линейной ДНК в кольцо лигированием по образовавшимся тупым концам. В этом случае размер делеции соответствует размеру одноцепочечных липких концов в сайтах рестрикции. Кроме того, такой метод допускает простую проверку наличия мутаций в требуемом участке ДНК, так как в результате мутации происходит потеря уникального сайта рестрикции. Для получения вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемые участки клонируемых генов также разработаны эффективные и надежные методы. В простейшем случае такая задача решается путем расщепления исследуемого гена рестриктазой по уникальному сайту рестрикции и встраивания по этому сайту фрагмента природной ДНК или синтетического двухцепочечного олигонуклеотида, который фланкирован соответствующими липкими концами. Лигирование может проводиться и по тупым концам. В таком случае последовательности нуклеотидов на концах вставки уже не имеют существенного значения для встраивания этого фрагмента по сайту рестрикции. [c.289]

Олигонуклеотид — короткая однонитевая молекула ДНК и РНК (16—30 пар нуклеотидов). [c.355]

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот [34]. Если в 60-х годах разделение нуклеиновых кислот по молекулярным массам вели в основном путем ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, то в 70-х годах этот метод вытесняется методом электрофореза в геле. Впервые он был широко применен болгарским исследователем Р. Цаневым и сотр., и затем быстро завоевал общее признание. Оказалось, что в геле ДНК и РНК движутся тем быстрее, чем ниже их молекулярная масса. Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму молекулярной массы. Особенно важно, что разрешающая способность метода благодаря низкой диффузии гораздо выше, чем у ультрацентрифугирования. Для низкомолекулярных нуклеиновых кислот электрофорез ведется в полиакриламидном геле, для высокомолекулярных — в агарозном. Чем ниже концентрация геля, тем более высокомолекулярные нуклеиновые кислоты могут в нем разделяться. Подбирая условия, можно разделить как короткие олигонуклеотиды, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид, так и молекулы ДНК размером до нескольких миллионов пар нуклеотидов. [c.27]

С ионообменных фильтров ( Whatmann DE-81 ), где ионная фиксация молекул идет во всей толще фильтра, нуклеотиды или короткие олигонуклеотиды лучше элюировать 0,5 М раствором Na l в 1 М НС1. Полимерные нуклеиновые кислоты с этих фильтров элюировать трудно. [c.217]

Олигонуклеотид, олигомер (Oligonu leotide) Короткий (6—10 нуклеотидов) сегмент одноцепочечной ДНК. Обычно получают химическим путем. [c.555]

Тиминовые димеры вырезаются при помощи ферментов репарации. У Е. oli специфичная нуклеаза, вырезающая тиминовый димер, кодируется тремя генами, белковые продукты которых после ассоциации образуют активный комплекс, функционирующий при участии АТФ. Этот комплекс присоединяется к цепи ДНК и производит два разрыва на расстоянии семи нуклеотидов от 5 -конца тиминового димера и четырех нуклеотидов от З -конца этого же димера. После вырезания поврежденного олигонуклеотида однонитевый участок неповрежденной цепи защищается при помощи SSB-белка от непрограммируемой деградации. Заполнение бреши происходит при помощи ДНК-полимеразы I, синтезирующей короткие олигонуклеотидные фрагменты ДНК. Эти фрагменты затем при помощи ДНК-лигазы ковалентно присоединяются к цепи ДНК. Таким образом, полностью устраняются повреждения, и восстанавливается нативная двухцепочечная спираль ДНК. [c.454]

Установлено, что при ионофорезе на ДЭЛЭ-бумаге в растворителе с pH 1,9 все фосфорилированные нуклеотиды движутся быстрее соответствующих нуклеотидов, содерямщих дополнительный нуклеотидный остаток у 5 -конца. Следовательно, разные нродукты, образующиеся нри деградации олигонуклеотида экзонуклеазой, можно разделить в этой системе но нх длине длинные фрагменты дрижутся медленнее коротких. Расстояние на карте между любыми двумя нуклеотидами, отличающимися только па один остаток, будет зависеть от природы этого остатка. Следовательно, это расстояние дает возможность судить о природе разных остатков поэтому довольно часто можно определить полную последовательность остатков в олигонуклеотиде, проводя деградацию только один раз с носледу- [c.65]

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Продолжающийся поиск альтернативных возможностей определения нуклеотидной последовательности ДНК привел к разработке принципиально нового метода секвенирования ДНК посредством гибридизации. В его основу было положено представление, что вся последовательность ДНК состоит из коротких подпоследовательностей. Знание порядка нуклеотидов в них, а также расположение этих подпоследовательностей друг относительно друга позволяют реконструировать весь исследуемый фрагмент ДНК. Принцип определения нуклеотидной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК этим методом основан на образовании Уотсон-Криковских пар в результате проведения этапа гибридизации фрагмента ДНК с набором олигонуклеотидных зондов. Анализ характера гибридизации конкретных олигонуклеотидов позволяет провести реконструкцию секвенируемого фрагмента ДНК. [c.400]

Смотреть страницы где упоминается термин Нуклеотиды и короткие олигонуклеотиды: [c.286] [c.319] [c.24] [c.94] [c.196] [c.133] [c.59] [c.77] [c.402] [c.70] [c.326] [c.503] [c.326] [c.86] [c.342] [c.61] [c.61] [c.77] [c.58] [c.77] [c.278] [c.275] [c.64] [c.72] [c.74] [c.283] [c.408] [c.175] [c.480]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология