Олигонуклеотидные зонды

Нуклеотидную последовательность специфических олигонуклеотидных зондов (длиной 20-40 звеньев) находят из данных об аминокислотной последовательности соответствующих белков. [c.85]

А. Синтез пары олигонуклеотидных зондов [c.197]

Можно синтезировать и другие олигонуклеотидные зонды, полностью соответствующие последовательности с мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе зондов лигирование будет происходить в случае их отжига с мутантной ДНК-мишенью и не будет в случае отжига с нормальной мишенью. Таким образом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации лигирование зондов и отсутствие лигирования. [c.198]

Синтез олигонуклеотидного зонда [c.469]

Уникальный олигонуклеотидный зонд из 36 оснований [c.136]

Рис. 4.59, Олигонуклеотидный зонд (олигонуклеотид из 19 остатков) для гена нормального -глобина отличается от зонда для гена с мутацией, приводящей к -талассемии только заменой G -> А в интроне IVS-2. В соответствующих условиях гибридизации зонд для мутантного гена будет узнавать только мутантный ген, но не нормальный. Аналогичным образом нормальный зонд не будет гибридизоваться с мутантным геном.

Певзнер П.А., Миронов A.A. Выбор оптимальных олигонуклеотидных зондов для локализации генов//Математические и вычислительные методы в биологии. Пущино, 19876.С.85-86. [c.246]

Гибридизация с олигонуклеотидными зондами (не более 50 нуклеотидных звеньев). [c.36]

Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотидные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, т.е. гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой. [c.164]

Последним достижением зондовой техники является разработка коротких синте-. тических олигонуклеотидных зондов. Эти зонды представляют собой химически синтезированные одноцепочечные молекулы ДНК, содержащие всего около 20 пар оснований. Последовательности основания для пары зондов различаются всего одним нуклеотидом. Один зонд является комплементарным к ДНК с нормальной последовательностью, а другой к той же ДНК, содержащей точечную мутацию. Такая пара зондов будет различным образом гибридизироваться с нормальной и мутантной геномной ДНК, и, следовательно, наличие или отсутствие гибридизации можно использовать в качестве диагностического признака при онределении генетических нарущений, обусловленных точечными мутациями, таких, как -талассемия [22]. [c.68]

На рис. 5-61 показаны два участка полученного вашим коллегой белка, характеризующиеся наименьшей многозначностью, и соответствующие этим участкам олигонуклеотидные зонды. Кодоны приведены под последовательностью аминокислот в форме РНК, чтобы легче было перейти к генетическому коду. Олигонуклеотиды показаны в виде последовательностей ДНК, т.е. в том виде, в каком они будут синтезированы. (Комплементарные им последовательности тоже могут служить хорошими зондами.) [c.309]

С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены чело- [c.189]

Идентификация гена в отсутствие гетерологичного зонда или какой-либо информации об этом гене — задача не из легких. В таких случаях часто приходится разрабатывать принципиально новую схему отбора. В ее основе может лежать иммунологическая идентификация искомого белка, определение его активности, ДНК-гибридиза-ция с олигонуклеотидным зондом, нуклеотидная последовательность которого была определена исходя из данных о частично секвениро-ванной аминокислотной последовательности очищенного искомого белка, или комплементация мутантов. Очень часто после идентификации гена, кодирующего определенную функцию, можно выделить аналогичные гены из других организмов, используя первый вьщеленный ген в качестве гетерологичного зонда для ДНК-гибридизации. Результативность данного подхода зависит от близости нуклеотидных последовательностей зонда и искомого гена. Эта стратегия оправдывает себя в случае консервативных в эволюционном плане генов, например генов, кодирующих белки, которые участвуют в фиксации азота, но в больщинстве случаев она малопригодна. [c.319]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

Internet Line). Они созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна из них - ожидаемая нуклеотидная последовательность кодирующей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов. Нуклеотидную последовательность предполагаемого экзона можно использовать для поиска гомологичных ей последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью гена-мишени. [c.476]

Лигирование олигонуклеотидных зондов, ЛОЗ (Oligonu leotide ligation assay) Метод выявления однонуклеотидных замен в гене-мишени с помощью коротких олигонуклеотидов, комплементарных противоположным цепям тестируемого отрезка ДНК. Если замена отсутствует, то оба олигонуклеотида полностью гибридизуются с ДНК, и после добавления в реакционную смесь ДНК-лигазы происходит их сшивание (лигирование). В противном случае сшивание оказывается невозможным. [c.552]

Прогулка по хромосоме ( hromosome walking) Метод идентификации нуклеотидных последовательностей, фланкирующих известные гены, для которых имеются олигонуклеотидные зонды. Фланкирующие последовательности используются затем в качестве зондов для идентификации прилегающих к ним последовательностей, и т,д. [c.557]

Был синтезирован олигонуклеотидный зонд (длиной в 36 нуклеотидов), соответствующий одному из пептидов, полученных после обработки фактора VIII трипсином. Этот очень короткий ДНК-зонд использовали для скринирования ) -фаговой библиотеки геномной ДНК человека с кариотипом 49,XXXXY. Следовательно, высокая концентрация Х-специфических фрагментов ДНК была получена не при помощи сортировки хромосом, как описано ранее (разд. 2.3.2.5), а благодаря природной аномалии. Клоны, выявленные с помощью гибридизации с ДНК-зондом (разд. 2.3), имели перекрывающиеся концы, благодаря чему оказалось возможной первичная идентификация какой-то части природного гена (рис. 2.91). [c.135]

Рис. 2.91. Анализ гена фактора VIII человека, начинающийся с получения олигонуклеотидного зонда длиной в 36 оснований.

Одна из наиболее часто возникающих проблем при анализе биологических текстов - поиск гомологий. И это понятно, поскольку схожесть текстов позволяет делать выводы об их эволюционной и/или функциональной близости. Здесь можно привести пример обнаруженной гомологии между определенными типами онкогенов и клеточными генами (НаЬагго et а1., 1984), что привело к возникновению нового направления исследований. Гомологии между последовательностями часто используют для реконструкции эволюционных деревьев. Такие важные аспекты анализа биологических текстов, как поиск повторов, палиндромов, симметричных участков, сайтов рестрикции, также связаны с проблемой поиска гомологий. Анализ гомологий необходим также при подготовке и проведении целого ряда экспериментальных работ, в частности при синтезе олигонуклеотидных зондов для поиска клонов в клонотеке, стыковке фрагментов нуклеотидных последовательностей при секвенировании протяженных участков ДНК или целых геномов и др. [c.11]

Очень важной модификацией метода является гибридиза-ционный скрининг с радиоактивно меченным олигонуклеотидом, который применяется для мутагенеза. В данном случае этот олигонуклеотид служит зондом. Показано, что прочность гибридов сильно различается из-за того, что при гибридизации олигонуклеотид-зонд полностью комплементарен мутантной форме ДНК, а дикой форме ДНК одна пара оснований не комплементарна. На практике переносят отпечатки негативных колоний с чашки Петри на нитроцеллюлозный фильтр, проводят гибридизацию с олигонуклеотидным зондом при условиях, когда гибри-дизуются обе формы ДНК. Затем фильтр последовательно промывают при все более высокой температуре. Можно, таким образом, подобрать условия, при которых на радиоавтографе фильтра зоны почернения будут отвечать только мутантным формам ДНК. Этот метод особенно ценен тем, что позволяет изолировать мутации без их фенотипического проявления. [c.162]

Задача оказалась достаточно сложной. К началу исследований отсутствовали данные о структуре белка, что исключало возможность использования как синтетического гена, так и синтетических олигонуклеотидных зондов для скрининга гибридных клонов. Кроме того, было известно, что при максимальной индукции клеток доля интерфероновой мРНК в общем пуле поли(А)-мРНК весьма мала. Это предопределило очень большой объем работ по скринингу гибридных клонов. [c.190]

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рас-севают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры [235, 236]. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. [c.163]

Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд олигонуклеотидных зондов и использовать их для скрининга клонотеки генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК, так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная длина которых может значительно (на два-три порядка) превышать таковую значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек особенно остро встает вопрос об их репрезентативности, поскольку внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК, гибридизующей-ся с упомянутыми выше олигонуклеотидными зондами, можно [c.251]

В 3 случаях при наличии клинически выраженной МД не было выявлено экспансии при гибридизации продуктов ПЦР с олигонуклеотидным зондом. Все эти больные являются спорадическими и, при проведении исследования ДНК из образцов крови, полученных от этих пациентов, с использованием денатурирующего электрофореза было выявлено наличие двух аллелей нормальной длины. Иногда отсутствие удлиненного аллеля при наличии клинических симптомов, характерных для МД, может быть связано с поражением другого локуса DM-2, картированного на 3-й хромосоме, и приводящего к развитию сходного заболевания, названного позднее проксимальная миотоническая миопатия (ПММ) (Ranum et al., 1998 Nestor et al., [c.320]

Олигонуклеотидные зонды представляют собой синтетические одноцепочечные молекулы ДНК длиной приблизительно в 20 оснований. Такие зонды можно использовать для выявления точечных мутаций. Для этого требуется пара олигонуклеотидных зондов ОДИН комплементарный к нормальной и другой-к мутантной ДНК. Зонды гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК либо на блотинговых пленках Саузерна, либо в осушенном агарозном геле, и затем фильтр или гель промывают в таких условиях, чтобы плохо сопряженные ДНК-гибриды дестабилизировались и удалялись с фильтра, а гибриды из комплементарных молекул оставались на нем. Этот подход использовали для диагностирования серповидноклеточной анемии, Р-талассемии и а-1-антитрипсиндефицита [6, 13, 22]. [c.71]

Хотя показано, что Р-талассемия обусловлена по меньшей мере тридцатью точечными мутациями, в каждой отдельной популяции найдено лишь небольшое их число. В некоторых популяциях, например среди жителей Сардинии, за подавляюшее большинство случаев р-талассемии ответственна всего одна мутация. В такой популяции использование олигонуклеотидных зондов для пренатальной диагностики р-талассемии особенно удобно. Однако для генетических нарушений с высокой частотой новых мутаций, таких как гемофилия или мышечная дистрофия Дюшене, олигонуклеотидный метод непригоден и приходится прибегать к косвенному методу, в котором используется полиморфизм ДНК. [c.72]

Рис. 8-9. Гибридизация специфических олигонуклеотидных зондов с мРНК трипаносом, выделенных из человека (Ч) и из мухи цеце (М) (задача 8-21). Интенсивность полос на радиоавтограмме отражает концентрацию мРНК.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология