Методы определения места расщепления субстрата

Методы определения места расщепления субстрата [c.173]

При определении субстратной специфичности первых обнаруженных рестриктаз в начале в основном применялись только прямые биохимические методы анализа. Задача определения специфичности и места расщепления сайта тогда практически сводилась в один эксперимент — определение первичной структуры концевых участков по месту расщепления субстрата (49, 116, 144, 195]. С момента открытия первых рестриктаз методы определения специфичности перетерпели большую эволюцию, характерной чертой которой явилось всевозможное использование более быстрых и более простых как прямых так и косвенных методов. Привлечение косвенных методов, в основном коснулось только изучения сайтовой специфичности рестриктаз задача определения места расщепления субстрата и по сей день решается прямыми биохимическими методами. [c.170]

В заключение можно сказать, что современные методы анализа нуклеиновых кислот позволяют определить место расщепления субстрата для рестриктазы любой специфичности. Выбор стратегии и метода определения зависит от особенностей узнаваемого участка и методов, которыми владеет экспериментатор. [c.180]

Процедура определения места расщепления с использованием синтетического субстрата выглядит очень просто. Для этого олигонуклеотид, содержащий сайт исследуемой рестриктазы, метится по 5 -концу при помощи Т4-полинуклеотидкиназы и [Т— Р]АТФ, и обрабатывается исследуемым ферментом. Затем реакционную смесь анализируют при помощи ионообменной хроматографии в тонком слое ДЭЛЭ-целлюлозы. В качестве маркеров параллельно разделяют продукты лимитированного гидролиза этого же меченого олигонуклеотида. Место расщепления сайта определяется путем сравнения подвижности продуктов рестрикционной реакции и лимитированного гидролиза субстрата. Очевидно, что применение этого метода возможно лишь в тех случаях, когда узнаваемая последовательность рестриктазы уже определена другими методами. [c.179]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология