Полинуклеотидкиназа

Полинуклеотидкиназа — один из ферментов, обеспечивающих условия для протекания ДНК-лигазной реакции. С участием АТФ полинуклеотидкиназа активирует концы одноцепочечных разрывов в ДНК, которые затем соединяются в непрерывную цепь ДНК-лигазой. [c.67]

Метильные группы удаляют с помощью химической обработки непосредственно в реакционной колонке. Затем отсоединяют олигонуклеотиды от спейсерной молекулы вместе с 3 -гидроксильным концом и элюируют их из колонки далее последовательно удаляют бензоильные, изобутирильные и ДМТ-группы. 5 -ко-нец цепи фосфорилируют ферментативным (полинуклеотидкиназа Т4+АТР) или химиче- [c.84]

Для ДНК концевая метка может быть введена ферментативным путем. Чаще всего для этой цели используют фермент полинуклеотидкиназу, специфически катализирующую перенос остатка фосфорной кислоты от молекулы АТФ к 5 -гидроксигруппе 5 -концевого фрагмента ДНК. Этот фрагмент производится в Е.соИ, зараженной бактериофагом Т4, который содержит ген, программирующий синтез этого фермента. Если исходная ДНК содержит в 5 -положении остаток фосфорной кислоты, то его можно предварительно удалить с помощью другого фермента — фосфомоноэстеразы (щелочной фосфатазы), катализирующей отщепление ортофосфата от моноэфиров фосфорной кислоты. Чаще всего для этой цели используется фермент из Е.соИ. В целом схему введения 5 -концевой метки в ДНК можно представить следующим образом [c.267]

Ферменты. В указанных выще методах применяются следующие ферменты эвдонуклеазы или рестриктазы обратная транскриптаза или ревертаза ДНК-лигазы экзонуклеазы щелочная фосфатаза полинуклеотидкиназа концевая дезаксинуклеотидилтрансфераза ДНК-полимераза. [c.499]

Т4-полинуклеотидкиназа широко используется для фосфори-лирования олиго- и полинуклеотидов при работе с рекомбинантными ДНК, при химико-ферментативном синтезе нуклеиновых кислот и определении их последовательности. [c.353]

Наконец, для специфического введения метки по 5 -концевой гидроксильной группе в ДНК можно использовать специфическую ферментативную реакцию — фосфорилирование под действием Р-аденозин-5 -трифосфата 204-206 3.5,3 реакция катализируется ферментом полинуклеотидкиназой из Es heri hia oli, инфицированной фагами Т2 или Т4. В том случае, если полимер оканчивается остатком нуклеозид-5 -фосфата, концевая фосфатная группа может быть удалена обработкой фосфомоноэстеразой. [c.47]

Готовят три колонки с DEAE-целлюлозой следующих размеров Зх 10, 1 х10 и 1x5 см. Каждую колонку промывают стартовым буфером, содержащим 0,01 М фосфат калия ( jH 7,5 ) и 0,01 М меркаптоэтанол. Фракцию 4 диализуют против стартового буфера в течение 5 ч, затем в пять раз разбавляют тем же буфером. Разбавленный раствор фермента наносят на колонку размером 3 х10 см и промывают 200 мл стартового буфера. Фермент элюируют буфером, содержащим 0,05 Л/ фосфат калия (pH 7,5) и 0,01м меркаптоэтанол, и фракции, обладающие полинуклеотидкиназ— ной активностью (методика определения приведена ниже), объединяют (фракция 5). [c.285]

В олигорибонуклеотиды. полученные после обработки выделенных тРНК рибонуклеазой Т, вводили радиоактивную метку с помощью Т4-полинуклеотидкиназы. Смесь под [c.189]

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу вьщеления исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом Р в 5 -конце с использованием [у - Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь звездочка обозначает радиоактивную метку Р на 5 -конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5 -конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З -кон-цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле бок о бок . Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5 -конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. [c.273]

Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В первом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е oli вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65. А). Нри этом получают радиоактивные ДНК-зонды . используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе фермент полинуклеотидкиназа из бактериофага [c.233]

Установление точек действия различных рестриктаз позволяет проводить физическое картирование участков молекулы ДНК и небольших геномов (плазмид вирусов). Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может быть использовано для его идентификации. Принцип рестрикционного картирования сводится к получению перекрывающихся по размеру фрагментов, которые разделяют при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Молекулярную массу фрагментов обычно определяют, используя в качестве свидетеля ДНК известного размера. На электрофо-реграмме рестрикты-фрагменты ДНК различают, окрашивая их бромистым этидием и просматривая гель в ультрафиолетовом свете. Применяют также радиоактивное мечение концов фрагментов с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. [c.283]

Метить радиоактивным изотопом фосфора Р удобнее с помощью фермента полинуклеотидкиназы фага Т4 и Р 7 АТФ [c.284]

Расщепление этого фрагмента на более мелкие с помощью эндонуклеаз рестрикации и мечение образовавшихся концов (с помощью полинуклеотидкиназы и РуАТФ или при застройке липких концов большим фрагментом ДНК-полимеразы I, сохранившим полимеразную, но не экзонуклеазную активность — см. гл. 6 — в присутствии нуклеозидтрифосфатов, один из которых мечен Р в а-положении). На этом этапе обычно получаются фрагменты, меченные с обоих концов, поэтому каждый меченый фрагмент выделяют из геля и либо подвергают электрофорезу для разделения цепей, либо гидролизуют еще одной рестриктазой для получения субфрагментов, несущих Р только с одного конца. [c.285]

Полинуклеотидкиназа осуществляет перенос у фосфатных групп с АТФ на он - 5 -конец ДНК (прямая реакция). В присутствии АДФ она способна осуществлять также реакцию обмена между АТФ и фосфорилированным 5 концом ДНК. Первая реакция протекает более эффективно, но требует предварительного дефосфорилирования фгагмента ДНК с помощью фосфатазы. [c.14]

Т4-полинуклеотидкиназа способна присоединять 7-фосфат из АТФ на 5 -ОН-концы однонитевых и двунитевых молекул ДНК и РНК. Краткие сведения о ферменте Л1=140000 рНопт=7,6 активаторы — полиамины, дитиотреитол (ДТТ) удель- [c.256]

Аналогичную систему двумерного электрофореза олигонуклеотидов (сначала по зарядам при pH 3,5, потом по размерам) можно использовать и после полного гидролиза РНК какой-либо специальной рибонуклеазой, например РНКазой Т1. Тогда совокупность фрагментов РНК, оканчивающихся гуанином, может служить для расшифровки последовательности этой РНК. В целях авторадиографического обнаружения и последующей элюции соответствующих пятен фрагменты в исходной смеси после гидролиза можно пометить радиоактивным фосфором по их 5 -концам с помощью Р-АТФ и полинуклеотидкиназы. [c.147]

Смотреть страницы где упоминается термин Полинуклеотидкиназа: [c.20] [c.174] [c.208] [c.493] [c.503] [c.506] [c.17] [c.20] [c.329] [c.353] [c.283] [c.284] [c.285] [c.285] [c.182] [c.123] [c.39] [c.39] [c.172] [c.172] [c.256] [c.64] [c.159]

Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (1990) -- [ c.17 ]

Биохимия Том 3 (1980) -- [ c.177 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.17 ]

Биологическая химия (2002) -- [ c.267 ]

Аффинная хроматография (1980) -- [ c.4 , c.310 ]

Органическая химия нуклеиновых кислот (1970) -- [ c.47 , c.79 ]

Биохимический справочник (1979) -- [ c.67 ]

Современная генетика Т.3 (1988) -- [ c.273 ]

Генетика с основами селекции (1989) -- [ c.283 , c.284 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.64 , c.159 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.221 , c.323 ]

Биосенсоры основы и приложения (1991) -- [ c.69 ]

Биохимия Т.3 Изд.2 (1985) -- [ c.64 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология