Определение субстратной специфичности рестриктаз

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ РЕСТРИКТАЗ [c.170]

В настоящее время, как уже отмечалось, известны 143 прототипа рестриктаз. Таким образом, имеется возможность расщеплять ДНК по 143 различающимся по структуре участкам. В конкретных экспериментах весь этот набор конечно не используется. Вместе с тем успешное решение таких задач, как физическое картирование различных ДНК, выделение их фрагментов, определение нуклеотидной последовательности, разрыв ДНК в желаемом месте (например, сразу за структурной частью гена) во многом зависит от возможностей, представленных существующими вариантами субстратной специфичности рестриктаз. Учитывая большое структурное разнообразие ДНК очевидно, что имеющийся набор этих ферментов еще далек от удовлетворения всех нужд научных исследований. Поэтому поиск рестриктаз, обладающих способностью специфически расщеплять ДНК в ранее недоступных для этого местах, не теряет [c.65]

При определении субстратной специфичности первых обнаруженных рестриктаз в начале в основном применялись только прямые биохимические методы анализа. Задача определения специфичности и места расщепления сайта тогда практически сводилась в один эксперимент — определение первичной структуры концевых участков по месту расщепления субстрата (49, 116, 144, 195]. С момента открытия первых рестриктаз методы определения специфичности перетерпели большую эволюцию, характерной чертой которой явилось всевозможное использование более быстрых и более простых как прямых так и косвенных методов. Привлечение косвенных методов, в основном коснулось только изучения сайтовой специфичности рестриктаз задача определения места расщепления субстрата и по сей день решается прямыми биохимическими методами. [c.170]

Относительное картирование заключается в обработке субстратов с известной первичной структурой исследуемым ферментом в смеси с некоторыми известными рестриктазами и сравнение величин полученных фрагментов с расчетными. Относительное картирование с методической точки зрения ничем не отличается от точного. И в этом и в другом случае проводится обработка субстрата смесью исследуемого фермента с известными (попарно) и определение величин получаемых фрагментов. Путем логических рассуждений с учетом координат участков, узнаваемых использованными в опытах рестриктазами с известной субстратной специфичностью, можно определить местоположение точек, расщепляемых исследуемым ферментом. Однако, в тех случаях, когда проверяется субстратная специфичность новой рестриктазы, предсказанная на основе других опытов, в этом нет необходимости, так как координаты ее предполагаемого участка узнавания относительно сайтов расщепления известных рестриктаз могут быть рассчитаны на основе данных о первичной структуре используемых субстратов. Сравнение расчетных данных с экспериментальными сразу без дополнительных рассуждений дает ответ, является ли предполагаемая последовательность нуклеотидов субстратом исследуемого фермента. Кроме того, в этом случае допустима обработка субстрата не всеми комбинациями известные рестриктазы — исследуемая, необходимыми для точной локализации точек расщепления последней. Это тоже снижает трудоемкость экспериментов. Учитывая тот факт, что таким способом проверяется относительное расположение многих сайтов узнавания, надежность определения субстратной специфичности исследуемой рестриктазы методом относительного картирования является высокой. [c.173]

Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Последнее свойство обсуждаемого метода оказывается очень важным в тех случаях, когда в фракционируемой смеси содержится более чем одна рестриктаза. Кроме того, снижение интенсивности и четкости зон ДНК позволяет судить о наличии в фракциях неспецифических нуклеаз. Однако, электрофоретический метод наряду с отмеченными достоинствами имеет существенный недостаток, выражающийся в том, что количественное определение активности исследуемых ферментов проводится путем оценки перехода неполное расщепление—полное расщепление субстрата. Для того, чтобы идентифицировать этот переход, необходимо проводить обработку субстрата различными количествами фермента, что значительно увеличивает число анализируемых проб. Если учесть, что в ходе хроматографической очистки такой оценке подлежат многие десятки фракций, трудоемкость количественного определения активности рестриктаз электрофоретическим методом в таких опытах становится очевидной. Однако использование именно этого метода оправдывает себя в случае определения активности конечного препарата, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента. В этом случае необходимо знать количество фермента, обеспечивающее исчерпывающее специфическое фрагментирование [c.127]

В тех случаях, когда продукты рестриктазной реакции имеют полностью спаренные концы, анализ 5 -концевой последовательности дает информацию лишь о структуре половины сайта. В отсутствии сведений об узнаваемом участке, полученных независимыми методами (например, косвенными), для большей достоверности анализ З -коицов является необходимым. Чаще всего для этой цели используется метод анализа ближайших соседей. В таких случаях применение ДНК полимеразы Т4, благодаря присущих ей полимеразной и 3 ->-5 экзонуклеазной активностей, позволяет в присутствии меченных нуклеозидтрифос-фатов ввести 2Р-меченый З -концевой нуклеотид. После гидролиза рестриктов соответствующими фосфодиэстеразами и анализа продуктов реакции определяется ближайший сосед включенного меченого предшественника [99, 166]. В результате такого анализа устанавливается структура З -концевого динуклеотида рестрикционного фрагмента. Обсуждаемый методический подход нашел применение в экспериментах по определению субстратной специфичности рестриктаз Xma I [92] и Hind III [195]. [c.176]

Обсуждаемый метод наиболее эффективен в самых простых случаях проявления специфичности рестриктаз, т. е. когда фермент узнает палиндромную последовательность нуклеотидов и разрыв фосфодиэфирных связей производит в ее пределах. Он успешно используется и в тех случаях, когда в узнаваемом участке наблюдается вырожденность. Рестриктазы Sau96 I [202], Sin I [167], Aos II [85], Fdi I 280] и Асу I [84], узнающие такие последовательности, были охарактеризованы с использованием метода нуклеотидных карт. Однако в общем случае он малопригоден для определения структуры более вырожденных узнаваемых участков. В этих случаях, а также когда расщепление происходит за пределами субстратного участка, задача определения его структуры, а также места разрыва, осложняется. Однако это не исключает возможности применения обсуждаемого метода с этой целью. В таких случаях анализу подвергаются выделенные индивидуальные ДНК-рестрикты, содержащие метку только в одном из концов анализируемого фрагмента. Такой прием был использован в опытах по определению субстратной специфичности рестриктазы NspB II [91], узнающей 5 -С(А/С)G (T/G)G последовательность. [c.177]

Имевшиеся к началу рассматриваемых исследований литературные сведения о распространенности рестриктаз [312], как уже отмечалось, мало что давали для обобщений, касающихся качественных ее аспектов. Однако, уже в то время было отмечено наличие ферментов, обладающих идентичной субстратной специфичностью (изошизомеры), у представителей различных, иногда отдаленных таксонов прокариотических микроорганизмов. Обнаружение явления изошизомерии было принято как указание на отсутствие строгой таксоноспецифичности рестриктаз [312]. Под этим термином подразумевается такой вариант таксоноспецифичности, когда рестриктаза определенной субстратной специфичности имеется только в штаммах одного вида. [c.25]

Для определения субстратной специфичности первой открытой рестриктазы П типа — Hind П [144] было использовано введение метки в 5 -концы фрагментов ДНК, генерируемых ис- [c.173]

В работах, посвященных изучению наиболее многочисленной группы эндонуклеаз, которые по своей субстратной специфичности могли бы быть отнесены к рестриктазам II типа, в основном их характеристика ограничивается определением узнаваемого участка, места расщепления субстрата и определением потребности в ионах магния. По мере накопления информации о типах построения узнаваемых участков выявилась определенная гетерогенность этой группы ферментов. Так рестриктазы, узнающие ассимметрическую последовательность нуклеотидов и расщепляющие ДНК в стороне от нее, обозначены IIS [364]. Закономерно вставал вопрос о том, что еще большая гетерогенность могла бы быть обнаружена при изучении других дифференцирующих признаков, например, структурной организации и реакции на другие кроме ионов магния кофакторы (АТФ, Адо-мет). [c.8]

В контексте настоящего обзора отдельного обсуждения заслуживает субстратная специфичность и характер расщепления ДНК сравниваемыми типами рестриктаз — показатель, имеющий наибольшее практическое значение, если задаться целью их использовать в качестве аналитических реагентов. Рестрик-тирующие эндонуклеазы всех типов отличаются исключительно высокой субстратной специфичностью — каждая узнает последовательность нуклеотидов строго определенной длины и состава. Основное различие между ними заключается в характере расщепления субстрата. В случае рестриктаз I типа это происходит в стороне от узнаваемого участка на большом расстоянии (более 1000 пар нуклеотидов) и случайным образом (179, 269), что исключает возможность использования этих ферментов для специфического фрагментирования ДНК. [c.11]

Если вернуться к вопросу о строгой таксоноспецифичности некоторых рестриктаз, представляющей другой аспект обсуждаемой проблемы, то следует отметить, что он еще более трудно доказуем, чем вопрос об ограниченной вариабильности субстратной специфичности. В 1976 г. были охарактеризованы 22 рестриктазы с различной субстратной специфичностью [312]. Среди них 14 прототипов встречались только в одном штамме. К концу 1988 г. из прототипов, обнаруженных в 1976 г., только один (Нае I) не имел изошизомера [319]. Таким образом, существующая тенденция появления рано или поздно изошизомеров прототипов говорит в пользу предположения об отсутствии (или по меньшей мере ограниченности) строгой таксоноспецифичности рестриктаз и скорее всего можно говорить о разной распространенности изошизомеров определенных типов специфичности. [c.30]

Значительная часть исследований, в особенности на первом этапе изучения рестриктаз, была посвящена поиску, очистке и характеристике специфичности рестриктаз. Это направление исследований не потеряло своей актуальности и в настоящее время и стимулируется как желанием обнаружить новые по специфичности ферменты с целью их дальнейшего применения в качестве аналитических реагентов, так и необходимостью изучения таких фундаментальных вопросов как закономерность распространения рестриктаз и вариабильность их субстратной специфичности. В настоящем разделе будут рассмотрены некоторые методические аспекты решения обсуждаемых, а также ряда других задач (определение активности, клонирование генов рестрикции-модификации). [c.126]

Требования к уровню функциональной чистоты препаратов рестриктаз, используемых в опытах по определению их субстратной специфичности, далеко не одинаковы и диктуются заданной глубиной исследования этой характеристики. В случае применения рестриктаз в качестве аналитических реагентов качество препаратов, в зависимости от сферы применения, тоже может варьировать. В опытах по физическому картированию допустимо использование ферментов, содержащих в качестве примесей нелимитированное количество фосфатаз. Уровень присутствия неспецифических нуклеад ограничивается та- [c.141]

Стремительный рост числа новых рестриктаз и определение основных типов их субстратной специфичности [183] привел к появлению самого простого из косвенных методов, так называемого метода визуального сравнения, сущность которого заключается в сопоставлении результатов расщепления одного и того же субстрата известной и исследуемой рестриктазами. Так как при действии какой-либо рестриктазы на индивидуальную ДНК образуется характерный набор рестриктов, то в случае совпадения картин их электрофоретического разделения (ре-стриктограмм), делается вывод об идентичной специфичности этих ферментов. Иногда применение этого метода сводится к сравнению полученной рестриктограммы с таковыми, представленными в каталожных изданиях [189]. Очевидно, что настоящий метод пригоден только для характеристики аналогов уже известных рестриктаз (изошизомеров). Следует однако отметить, что такая оговорка недействительна в случае впервые обнаруженных рестриктаз с палиндромной сайтовой специфичностью, так как все варианты предполагаемого электрофоретического распределения фрагментов в этом случае рассчитаны на ЭВМ и в графическом виде представлены в справочной литературе [190]. [c.171]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология