Ренатурация гетеродуплексов

РИС.3.9. Схематическое изображение плавления ДНК и образования гетеродуплекса при ренатурации. Показана только одна из двух эквивалентных пар гетеродуплексов, которые могут образовываться в каждой из рассмотренных смесей ДНК. [c.165]

Если эксперименты по получению гетеродуплексов начинают с КЗК-ДНК, желательно ввести одноцепочечный разрыв таким образом, чтобы при денатурации образовались две интактные молекулы — одноцепочечная линейная и одноцепочечная кольцевая. Этого достигают следующим образом сначала отделяют КЗК-молекулы от всех других и затем производят слабую обработку дезоксирибонуклеазой или облучают видимым светом в присутствии бромистого этидия [3]. При такой слабой обработке образуются лишь одноцепочечные разрывы. КЗК-ДНК плазмид можно также расщеплять рестрик-тазами в условиях, когда расщепление происходит только по одному месту. Денатурацию обычно проводят прогреванием или обработкой щелочью. Способ, применяемый для денатурации ДНК, должен быть достаточно эффективным для того, чтобы привести к полному расхождению цепей, однако воздействие не должно быть настолько сильным, чтобы вызвать деградацию ДНК и внести дополнительные разрывы. Для ренатурации в водном растворе требуется высокая концентрация соли и нагревание до температуры примерно на 30 °С ниже температуры плавления (Тт)- Однако и соль в высокой концентрации, и высокая температура могут привести к одноцепочечным разрывам. Поэтому ренатурацию лучше осуществлять с формамидом — растворителем, эффективно снижающим Тт- При этом пригодны достаточно разведенные растворы ДНК, а реакцию можно проводить при температуре, равной или ниже комнатной, в течение более длительного времени. Оптимальна рена- [c.157]

Рис. 5-36. Образование смеси гетеродуплексов и гомодуплексов в результате денатурации и ренатурации двух различных геномов бактериофага лямбда, содержащих ТпЮ (задача 5-44). Фаговая ДНК изображена линиями, а Тп10 в виде прямоугольников. Мутационные различия между двумя элементами ТпЮ показаны белыми и черными сегментами.

При амплификации фрагментов генов гетерозигот, последующей денатурации и медленной ренатурации полученных продуктов ПЦР в амплификацион-ной смеси наряду с двумя типами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепями ДНК. Такие гетеродуплексные молекулы отличаются по электрофоретической подвижности от гомодуплексов за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов, поскольку электрофоретическая подвижность гетеродуплексов значительно ниже, чем гомодуплексов. Эти различия обнаруживаются при электрофорезе в обычном полиакриламидном геле. [c.267]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология