Гетеродуплексные молекулы

ДНК/ДНК-гибридизация гомологичные последовательности нуклеотидов в ДНК разных видов. Как мы уже говорили, при нагревании изолированной ДНК две полинуклеотидные цепи расходятся в результате разрыва водородных связей. Такая денатурация (или плавление ), приводящая к образованию одиночных цепей, обратима при очень медленном охлаждении препарата будет происходить спаривание и реассоциация комплементарных участков. Если смешать короткие фрагменты денатурированных ДНК, полученных из двух различных, но близких между собой видов бактерий, при температуре выше точки их плавления и затем медленно охладить смесь, тоже будет происходить реассоциация. Двойные спирали, образовавшиеся из одиночных цепей ДНК двух разных организмов, называют гетеродуплексными молекулами. Для того чтобы в эксперименте можно было проследить за образованием гетеродуплексов, нужно, конечно, пометить ДНК одной из бактерий тяжелым или радиоактивным изотопом. [c.41]

Исследование гетеродуплексных молекул, образованных ДНК мутанта и ДНК дикого типа, показало, что инсерционные мутанты содержат участки ДНК, встроенные в молекулу ДНК дикого типа (рис. 8.11). Было обнаружено, что несколько различных встраивающихся последовательностей могут вызывать мутации многих генов. Некоторые свойства наиболее известных из этих последовательностей представлены в табл. 8.1. Они различаются размером, но имеют некоторые общие черты строения. На концах содержатся одинаковые или почти одинаковые нуклеотидные последовательности, расположенные, однако, в обратном порядке. В случае IS1, например, концевые последовательности содержат по 23 нуклеотида, 18 из которых одинаковы для обоих [c.241]

Если двум частично комплементарным цепям плазмидной ДНК дать возможность ренатурировать, то образуются гетеродуплексные молекулы, которые можно исследовать с помощью электронного микроскопа. Поскольку при электронно-микроскопическом анализе в случае соответствующего приготовления образцов одно-и двухцепочечные участки нуклеиновых кислот различаются, существует возможность картирования гомологичных и негомологичных участков. С тех пор как в практику вошли способы проверки с применением рестриктаз и методы выявления гомологий ДНК в растворе по радиоактивности, методология гетеродуплексного анализа с помощью электронного микроскопа перестала широко применяться для анализа плазмидной ДНК- Хотя техника такого анализа требует большого экспериментального искусства и специального оборудования, она все же заслуживает рекомендации как способ точной локализации различий между плазмидами и наилучшей оценки организации плазмидной ДНК- [c.156]

Теперь сетки готовы к просмотру в электронном микроскопе. 20 разных гетеродуплексных молекул дают [c.161]

ОДНОГО штамма смешать с г-цепями другого штамма и подвергнуть их отжигу , то будет наблюдаться образование двухцепочечной ДНК-Поскольку, однако, в одном штамме имеется делеция, гомологичная область нормальной ДНК фага Я образует одноцепочечную петлю, которую можно легко увидеть при помощи электронного микроскопа. На рис. 15-24 в качестве примера показана электронная микрофотография такой гетеродуплексной молекулы с делеционной петлей. На этой фотографии виден также пузырь ( bubble ), образованный в том месте, где в одну из нитей был включен фрагмент негомологичной ДНК [c.263]

Рис. 15.24. Доказательство наличия спонтанно инвертируемой последовательности в регуляторной области оперона H2- 1. А. Плазмиду, содержащую клонированную регуляторную область оперона, размножают для получения больщой популяции плазмидных молекул, которые затем линеаризуют обработкой рестриктазой E o R1 (плазмида содержит единственный сайт для E O RI). Далее проводят денатурацию ДНК и отжиг. Б. Образовавшиеся гетеродуплексные молекулы ДНК анализируют с помощью электронного микроскопа. О-образный участок него-мологии,

Контроль вариации фаз зависит от состояния промотора, направляющего транскрипцию генов Н2 и гН1. Это было показано с помощью клонирования соответствующей регуляторной области на плаз-мидном векторе с использованием методов, описанных в гл. 9. При выращивании клеток Е.соИ, содержащих плазмиду со встроенной регуляторной областью, можно получить огромную популяцию идентичных молекул. Плазмидную ДНК очищают и линеаризуют с помощью рестриктазы со RI (рис. 15.24). Денатурация и отжиг цепей ДНК приводит к образованию гетеродуплексов, содержащих цепи из различных исходных плазмидных молекул. Некоторые из этих гетеродуплексных молекул содержат негибридизующийся участок протяженностью около 800 п.н. (рис. 15.24). Появление этого участка, как оказалось, вызвано тем, что в некоторых плазмидах произошла переориентация участка протяженностью 800 п. н. Это наблюдение позволило предложить модель механизма вариации фаз, согласно которой промотор генов Н2 и гН1 может находиться в одной из двух ориентаций ( флип или флоп ). В одной из них транскрипция с этого промотора приводит к образованию белков Н2 и гН1, При другой ориентации транскрипции этих генов не происходит (рис. 15.25). [c.201]

Рис. 15.5. Образование гетеродуплекса между К-плаз-мидой К6К и ее делецион-ным мутантом К5Р1040 [7]. Гетеродуплексные молекулы ДНК получали из ДНК Двух плазмид, подвергавшихся одноцепочечному разрыву под действием рентгеновских лучей по методике, описанной в разд. 15.3.5. Петля слева представляет собой одноцепочечную (хх) ДНК плазмиды Н6К, которая отсутствует из-за делеции в плазмиде КЗР 1040. Большая петля справа — двухцепочечная ДНК ( 5), по которой можно рассчитать область гомологии обеих плазмид. В данном случае двухцепочечная область составляет около 70% ДНК плазмиды НбК.

Другой способ предусматривает делетирование в рекомбинантной плазмиде сегмента, который предстоит мутировать. Далее исходную и делетированную плазмиды линеаризуют через разные единственные сайты рестрикции, денатурируют и проводят совместную ренатурацию. В результате наряду с исходными плазмидами образуются гетеродуплексные молекулы с однонитевой петлей в области мутируемого сегмента. После обработки смеси бисульфитом натрия и последующей трансформации клеток приступают к поиску мутантов. [c.264]

При амплификации фрагментов генов гетерозигот, последующей денатурации и медленной ренатурации полученных продуктов ПЦР в амплификацион-ной смеси наряду с двумя типами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепями ДНК. Такие гетеродуплексные молекулы отличаются по электрофоретической подвижности от гомодуплексов за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов, поскольку электрофоретическая подвижность гетеродуплексов значительно ниже, чем гомодуплексов. Эти различия обнаруживаются при электрофорезе в обычном полиакриламидном геле. [c.267]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология