Скрининг клонов, полученных в плазмидах

В том случае, когда ожидается с высокой вероятностью экспрессия клонированного гена, методы скрининга рекомбинантных клонов основываются либо на изменении фенотипа клетки под влиянием вновь синтезированного белка, либо просто на свойствах самого белка. Например, если необходимо изолировать гены Е. соИ, ответственные за биосинтез какой-либо аминокислоты, то отбирают рекомбинантные клоны, трансформируя гибридные плазмиды в ауксотрофные по биосинтезу аминокислот мутанты и получая прототрофные клоны. Это и есть тест на комплем 1и тацию. Прием очень удобный, но он исполь зуетея-ТУбычнопри самоклонировании , т. е. при переносе генов на многокопийных плазмидах в тот же микроорганизм, и требует наличия штаммов с хорошо охарактеризованными мутациями искомых генов. [c.154]

При реализации такого подхода из гена, клонированного в составе векторной плазмиды, по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который требуется внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонук-леотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на некоторых этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно определять функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами. [c.323]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология