Скрининг клонов

Для идентификации нужного гена человека используют четыре метода. В первом из них, функциональном картировании, на основе данных о генном продукте синтезируют зонды для скрининга кДНК-библиотеки. Положительный кДНК-клон, содержащий кодирующую область гена-мишени, используют для отбора геномных клонов и характеристики гена в целом. Второй подход, кандидатное картирование, основывается на выборе генов, которые по имеющимся [c.480]

Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмидами в них можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания геномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг. [c.76]

Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга геномной библиотеки необходимо определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген. [c.68]

Рис. 9.2. Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела. Вьщеляют клетки селезенки мыши, иммунизированной специфическим антигеном, и проводят их слияние с клетками миеломы, не вырабатывающими антитела. Слившиеся клетки отбирают по способности к росту на среде ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Клетки, вырабатывающие специфические антитела к иммунизирующему антигену (клетки гибридомы), идентифицируют иммунологическими методами и субкультиви-руют, чтобы получить отдельные клоны. Из гибридомы, растущей в культуре и секрсти-рующей единственный тип молекул антител, получают моноклональные антитела.

Скрининг клонов, полученных в плазмидах pUR [c.145]

Скрининг для отбора клонов, образующих специфические антитела против введенного антигена [c.314]

Если известна первичная структура гена или кодируемого им белка, или хотя бы их фрагментов, то для скрининга клонов можно использовать синтетические олигонуклеотиды — зонды. Экспериментально установлено, что зонды не должны быть короче 14 —15 п.о. Лучше брать два зонда одновременно к разным участкам одного и того же гена. В силу вырожденности кода, если известна только аминокислотная последовательность, приходится синтезировать набор олигонуклеотидов, из которых один будет полностью комплементарен к искомому гену. [c.155]

Рис. 25.9. Скрининг библиотеки с помощью ДНК-зонда с целью обнаружения клона.

Скрининг клонов Xgtll на продуцирование гибридных белков [c.144]

Моноклональные антитела. Доступность антимышн-ных IgG, меченных европием, позволила разработать простые методики скрининга клонов, продуцирующих антитела. Метод DELFIA дополняет существующие иммуноферментные методы скрининга моноклональных антител. [c.163]

Тестирование на синтез специфического полипептида in vitro. Иногда не удается провести прямой скрининг клонов потому, что просто отсутствует [c.295]

Следующий после создания библиотеки этап -это поиск клона (клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода гибридизацию с меченым ДНК-зондом с последующим радиоав-тографическим анализом, иммунологический скрининг и скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью. [c.64]

Синтез Н- и L-цепей происходит во время литического цикла бактериофага X, поэтому можно провести скрининг библиотеки клонов комбинаторных бактериофагов с целью определения их антигенсвязывающей активности. [c.218]

Синтезированные зонды использовали для скрининга банка клонов ДНК oryneba terium-, 1СЛОНЫ, гибридизующиеся только с одним из зондов, исключали из дальнейшего рассмотрения, считая, что соответствующая ДНК не является искомой. Выделяли клон, содержащий ген [c.250]

Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10-30 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза -задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержагцего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика [т. е. ген, восстанавливающий (комгглементиру-ющий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров. [c.259]

Для выявления рекомбинантных клонов, синтезирующих экзоглюканазу, использовали иммунный скрининг, позволяющий идентифицировать белок-мишень с помощью специфичных к нему антител секреция белка при этом необязательна. Рекомбинантные клетки лизи-ровали in situ (парами хлороформа), перенесли цитоплазматические белки на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и провели иммунологический тест. Использованный при этом метод реплик позволил сохранить жизнеспособные клетки для дальнейших исследований. [c.298]

Для вьщеления других генов, участвующих в фиксации азота, применяли два подхода. Во-первых, использовали банк клонов К. pneumoniae для комплементации независимо возникающих Nif -MyTaHTOB, увеличивая тем самым вероятность того, что в каждом случае будет выделен другой иг/-ген. Во-вторых, вьщеленные и//-гены использовали в качестве гибридизационных зондов для скрининга банка клонов хромосомной ДНК К. pneumoniae, несущих большие вставки (от 7 до 10 т. п. н.), исходя из того, что у прокариот гены одного пути биосинтеза обычно образуют кластеры. [c.310]

Рис. 20.18. STS-картирование. А. STS (с 1 по 15), обнаруженные с помощью ПЦР-скрининга в клонах а—е, обозначены знаком плюс (+). Буквами L и R указаны STS, находящихся на 5 - и 3 -концах вставки (на ее левом и правом концах соответственно). Б. Идентифицировав перекрывающиеся участки, можно построить контиг из пяти клонов и карту расположения STS. Полученные данные не позволяют установить порядок некоторых из них (номера в скобках). Интервалы между STS представлены одинаковыми в действительности они неизвестны.

Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы — это злокачественные новообразования иммунной системы они развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-антител. Иными словами, миеломы являются природными продуцентами моноклональных антител. По методу Миль-штейна проводят слияние нормальных (неопухолевых) лимфоцитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследств ии в результате элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миеломы. Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего искомое антитело, ведут при помощи биохимических и иммунохими-ческих методов. Схема этого метода дана на рис. 7.5. [c.313]

В том случае, если в каждом праймере содержатся рестрикционные сайты, клонируют ПЦР-продукт, несущий пойманный экзон, и используют последний в качестве зонда для скрининга кДНК-библиотеки. Зная нуклеотидную последовательность пойманного экзона, предпринимают поиск гомологичных ему последовательностей в базе данных. Если есть основания полагать, что пойманный экзон с большой вероятностью является частью гена данного заболевания, то характеризуют и секвенируют геномные клоны, охватывающие место расположения данного гена, и исследуют образцы ДНК больных и здоровых индивидов с целью выявления мутаций. Поскольку мутации, ответственные за патологию, не всегда бывают равномерно распределены по всем экзонам, чем больше размер сканированной кодирующей области предполагаемого гена, тем больше вероятность обнаружения мутации. [c.476]

Internet Line). Они созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна из них - ожидаемая нуклеотидная последовательность кодирующей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов. Нуклеотидную последовательность предполагаемого экзона можно использовать для поиска гомологичных ей последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью гена-мишени. [c.476]

Для визуализации эндоглюканаз в слое геля и скрининга продуцентов целлюлаз широкое распространение получили методы с использованием растворимых производных целлюлозы. Так, для отбора клонов в ходе генно-инженерных манипуляций используется метод, основанный на том, что низкомолекулярные продукты деструкции КМ-целлюлозы способны образовывать неокрашенный комплекс с красителем Конго красным. Поэтому в ходе проявления пластин и (или) на чашках Петри в месте локализации фермента образуется зона просветления, хорошо различимая на [c.141]

Смотреть страницы где упоминается термин Скрининг клонов: [c.144] [c.287] [c.352] [c.89] [c.404] [c.70] [c.115] [c.188] [c.209] [c.219] [c.298] [c.299] [c.463] [c.468] [c.469] [c.469] [c.470] [c.141] [c.623] [c.496] [c.477] [c.113] [c.333]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология