ПЦР с горячим стартом

Дополнительные неспецифические продукты могут образовываться и при безукоризненном отрицательном контроле. В этом случае причиной их появления могут быть слишком высокая концентрация праймеров или их чересчур большая вырожденность. В ряде случаев приходится менять праймеры, так как условия использования некоторых из них нельзя оптимизировать. Весьма часто избавиться от неспецифических продуктов в виде шмира или дискретных полос можно с помощью горячего старта и/илр1 гнездовой ПЦР, но у последнего подхода есть свои недостатки (см. ниже). Плохая денатурация матрицы также может приводить к появлению неспецифических продуктов. К тому же результату может приводить и высокая концентрация ионов Mg2+, дЫТРз или ДНК-полимеразы. В случае с ионами Mg2+, их концентрацию оптимизируют путем постепенного уменьшения с интервалом 0,2-0,5 мМ. Присутствие ингибиторов ПЦР в пробе часто отрицательно сказывается на специфичности реакции. [c.204]

Высокомолекулярный шмир на фоне дискретных продуктов ПЦР или при полном их отсутствии. Шмир очень часто возникает при использовании плохо очищенных матриц. При появлении шмира светится вся дорожка в агарозном геле после проведения электрофореза и окрашивания его бромистым этидием. В этом случае имеют место множественные неспецифические инициации синтеза ДНК из-за присутствия в реакционной смеси низкомолекулярных затравок в виде неспецифических фрагментов ДНК или РНК, а также повторяющихся последовательностей в матрице, которые залипают друг на друга. Денатурированные белки, неспецифически удерживая концы фрагментов ДНК вблизи матрицы, могут создавать места множественной инициации синтеза ДНК и т.п. Имеются, по крайней мере, две возможности преодоления такого эффекта дополнительная очистка матрицы, например, с помощью фенольной депротеинизации или с использованием ионообменной смолы СЬе1ех-100 [270], а также, если по каким-то причинам хорошо очищенные матрицы недоступны, применение модифицированных ДНК-полимераз в ПЦР с горячим стартом (см. ниже). [c.206]

Имеется несколько подходов, получивших название ПЦР с горячим стартом (hot start P R), которые позволяют достичь желаемого результата. В самых первых системах ДНК-полимеразу и остальную часть реакционной смеси разделяли с помощью легкоплавкого физического барьера (воска) [274]. При таком подходе все компоненты реакционной смеси, кроме ДНК-полимеразы и матрицы, вносят в нижнюю часть пробирки, на смесь наносят легкоплавкий полимер и пробирки прогревают с тем, чтобы он расплавился, и затем охлаждают до его застывания. Далее сверху наслаивают масло, а под масло вносят недостающие компоненты. Плавление барьера происходит в первом цикле ПЦР после прогревания пробирок до -55°С, что сопровождается объединением всех компонентов реакционной смеси, и ПЦР начинается. [c.210]

В альтернативных подходах объектом воздействия является непосредственно ДНК-полимераза. В одном случае образуют комплекс моноклональных антител с ферментом, в котором антитела инактивируются при прогревании в первом цикле ПЦР 275], в другом случае фермент модифицируют по некоторым аминокислотным остаткам термолабильными химическими группами, что делает его неактивным при комнатной температуре. Активация Taq-ДНК-полимеразы происходит после ее прогрева в течение 2-4 мин при 95°С [276]. Недостатком этого метода является снижение удельной активности Taq-ДНК-полимеразы, а, следовательно, и эффективности ПЦР в целом. Олигонуклеотидные аптамеры, специфически взаимодействующие с Taq-ДНК-полимеразой, также могут быть использованы для горячего старта [277]. Однако, по своей природе этот метод не является универсальным, так как в ряде случаев невозможно исключить взаимодействие аптамеров с праймерами или матричной ДНК. [c.210]

Наконец, в последнее время разработан вариант ПЦР с горячим стартом, в котором из реакции при низкой температуре выводятся праймеры, образующие характерную вторичную структуру, разрушающуюся при нагревании [278]. Для реализации этого подхода к 5-концам праймеров присоединяют одинаковые последовательности, которые отсутствуют в матричной ДНК. ПЦР проводят в присутствии трех праймеров двух, специфичных в отношении амплифицируемого участка ДНК, и одного, комплемен- [c.210]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология