Появление неспецифических продуктов ПЦР

Дополнительные неспецифические продукты могут образовываться и при безукоризненном отрицательном контроле. В этом случае причиной их появления могут быть слишком высокая концентрация праймеров или их чересчур большая вырожденность. В ряде случаев приходится менять праймеры, так как условия использования некоторых из них нельзя оптимизировать. Весьма часто избавиться от неспецифических продуктов в виде шмира или дискретных полос можно с помощью горячего старта и/илр1 гнездовой ПЦР, но у последнего подхода есть свои недостатки (см. ниже). Плохая денатурация матрицы также может приводить к появлению неспецифических продуктов. К тому же результату может приводить и высокая концентрация ионов Mg2+, дЫТРз или ДНК-полимеразы. В случае с ионами Mg2+, их концентрацию оптимизируют путем постепенного уменьшения с интервалом 0,2-0,5 мМ. Присутствие ингибиторов ПЦР в пробе часто отрицательно сказывается на специфичности реакции. [c.204]

Появление неспецифических продуктов ПЦР [c.203]

Дискретные неспецифические продукты. Исследование этого феномена в каждом случае требует индивидуального подхода. Например, по нашему опыту амплификация генетических локусов, содержащих повторяющиеся последовательности, может сопровождаться образованием нескольких воспроизводимых дискретных полос, которые не отражают гетерогенности длин исследуемого участка ДНК в геноме. Амплификация индивидуального клонированного продукта ПЦР в данном случае приводит к образованию точно тех же дискретных продуктов. Это указывает на то, что сам продукт ПЦР, образовавшийся в первых циклах, формирует гетерогенную матрицу. Конечно, причиной появления дискретных неспецифических полос могут быть и бо- [c.205]

В книге описаны некоторые математические приемы, основанные на применении теории инвариантов, пригодные для расчета того, какие продукты могут получиться при всевозможных дублетных реакциях данных молекул на неспецифических катализаторах и при пиролизе углеводородов. На основании указанных соображений выделен особый класс так называемых олистомерных реакций, для которых возможно несколько реакционных путей, и математически выведено условие появления олистомерии. Рассмотрение всех этих вопросов сопровождается обсуждением близких работ других авторов по сложным реакциям. [c.6]

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенирования и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности можег быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезамидирования амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина. [c.16]

Высокомолекулярный шмир на фоне дискретных продуктов ПЦР или при полном их отсутствии. Шмир очень часто возникает при использовании плохо очищенных матриц. При появлении шмира светится вся дорожка в агарозном геле после проведения электрофореза и окрашивания его бромистым этидием. В этом случае имеют место множественные неспецифические инициации синтеза ДНК из-за присутствия в реакционной смеси низкомолекулярных затравок в виде неспецифических фрагментов ДНК или РНК, а также повторяющихся последовательностей в матрице, которые залипают друг на друга. Денатурированные белки, неспецифически удерживая концы фрагментов ДНК вблизи матрицы, могут создавать места множественной инициации синтеза ДНК и т.п. Имеются, по крайней мере, две возможности преодоления такого эффекта дополнительная очистка матрицы, например, с помощью фенольной депротеинизации или с использованием ионообменной смолы СЬе1ех-100 [270], а также, если по каким-то причинам хорошо очищенные матрицы недоступны, применение модифицированных ДНК-полимераз в ПЦР с горячим стартом (см. ниже). [c.206]

Формирование биопленки лежит в основе нарастания слоев окислов металла в ходе образования так называемых конкреций . В этом случае абиогенное химическое окисление соединений железа уступает биогенному накоплению окислов железа. При этом адсорбированное двухвалентное железо реагирует с продуктами обмена веществ из клеточных чехлов и капсул, в частности, с биогенной перекисью водорода. Если предварительно суспензию клеток обработать каталазой (фермент, разрушающий Н2О2), накопление железа останавливается. Перекисный механизм окисления комплексообразующих соединений железа был обнаружен у типичных "железобактерий", а также при неспецифическом выделении перекиси в среду широким кругом бактерий с накоплением окислов железа в виде аморфного бесструктурного осадка. Неспецифичность указанной реакции появления перекиси водорода указывает на нецеле- [c.21]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология