Этидий бромистый

Внимание Бромистый этидий ядовит, поэтому все операции [c.175]

Рис. 9.6. Электрофоретический анализ ре- -стрикционных фрагментов ДНК. ДНК фага X инкубировали с различными указанными на рисунке рестриктазами время, достаточное Для того, чтобы во всех чувствительных сайтах произошло расщепление нуклеотидной последовательности. Образовавшуюся смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. Полосы идентифицировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием. Стартовые точки обозначены жирными стрелками. Интактная ДНК фага X представляет собой линейную молекулу длиной около 48 500 н. п. При действии рестриктазы ВдШ возникают фрагменты длиной 22800,

Рис. 4.4. Картирование сайтов рестрикции. А. Результаты гель-электрофореза фрагментов ДНК, полученных ее расщеплением указанными ферментами. Очищенную ДНК гидролизовали рестриктазами ЕсоК и ВатШ раздельно, а затем их смесью, проводили гель-электрофорез и визуализировали продукты окращива-нием бромистым этидием. Числа слева от горизонтальных полос -длина фрагментов в парах оснований. Б. Рестрикционная карта, построенная по электрофоретическим данным. Числа - расстояние между сайтами узнавания соответствующих ферментов.

Выход этидия бромистого равен 0,2 г (27,7%). [c.18]

Рис. 9.17. Метод Саузерна. Молекулы ДНК обрабатывают рестриктазами и образовавшиеся фрагменты подвергают электрофорезу в агарозном геле. Размеры рестрикционных фрагментов определяют по фотографиям геля, окрашенного бромистым этидием. Затем фрагменты денатурируют и переносят на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги. Фрагменты ДНК

Выход этидия бромистого равен 0,15 г (20,7%), т. пл. 238—240°. [c.18]

Бромистый этидий — Производное [c.218]

Нами при синтезе бромистого этидия вместо этилового эфира п-толуолсульфокислоты использован диэтилсульфат. [c.16]

Короткие фрагменты в агарозном геле мигрируют намного быстрее, чем длинные, при этом подвижность фрагментов ДНК в геле обратно пропорциональна логарифму массы (заряда) этого фрагмента. При окрашивании гелей красителями (например, бромистым этидием), связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает ре- [c.27]

Изолированная из нуклеоида ДНК, судя по ее реакции с бромистым этидием, ведет себя как замкнутая двухцепочечная структура. Маленькая молекула этого реагента встраивается (интеркалирует) между парами оснований ДНК и вызывает образование положительных супервитков в замкнутых кольцевых молекулах ДНК, у которых две цепи соединены ковалентно. В открытых кольцевых молекулах, содержащих одноцепочечный разрыв, или в линейных молекулах ДНК может свободно вращаться и таким образом освобождаться от дополнительного напряжения, создаваемого в результате включения бромистого этидия. [c.348]

В процессе выделения компактного нуклеоида вводится некоторое количество одноцепочечных разрывов такие же разрывы можно ввести в результате ограниченного гидролиза ДНКазой. Однако при этом не исчезает способность ДНК образовывать положительные супервитки в ответ на интеркаляцию бромистого этидия. Подобная реакция генома, содержащего одноцепочечные разрывы, в ответ на включение бромистого этидия говорит о том, что в нем должны существовать независимые [c.348]

Рис. 9.8. Электрофорез ПЦР-амплифи-цированных фрагментов растительной ДНК в полиакриламидном геле с последующим окращиванием бромистым этидием. Для амплификации фрагментов каждой из двух культур использовали три разных произвольных праймера. В случае праймеров А и В характер распределения полос в полиакриламидном геле для культур 1 и 2 совпадает, если же используется праймер Б, то положение полос различается. Таким образом, с помощью праймера Б можно выявлять различия между культурами 1 и 2.

Выявление свойств бактериальной плазмиды обычно начинают на генетическом уровне. Если есть подозрение на то, что какой-то бактериальный признак обусловлен плазмидой, в экспериментах по переносу генов часто можно показать передачу плазмидных детерминант независимо от хромосомных. Если же этот признак исчезает при обработке бактериальной популяции излечивающими агентами, такими, как акридиновый оранжевый или бромистый этидий, то можно быть почти уверенным в его плазмидном происхождении. В большинстве случаев, однако, необходимо непосредственно убедиться в существовании плазмиды и в том, что именно она определяет изучаемый генетический признак. [c.129]

В течение 2 ч при комнатной температуре, напряжении 120 В и силе тока 60 мА. Затем гель помещают в раствор бромистого этидия (0,4—1,0 мкг/мл) на 15 мии, после чего ДНК выявляют в дальнем ультрафиолете. [c.141]

Сравнивали картины полос фрагментов после окрашивания бромистым этидием (разд. 15.3.1). [c.144]

Гидролиз эндонуклеазой и электрофорез в агарозе с окраской бромистым этидием (разд. 15.3.1) описаны выше. Фрагменты ДНК, разделенные в 0,6%-ном агарозном геле (трубочка диаметром 0,6 см и длиной [c.144]

Для интеркаляции со сходным эффектом можно воспользоваться и более привычным красителем — бромистым этидием, в частности для очистки плазмидной сверхскрученной ДНК, подобно тому как это делают методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации раствора s l, но значительно проще и быстрее. В основе обоих методов лежит одно и то же явление — в линейную [c.238]

Очистку плазмидной ДНК от примеси РНК (после осаждения ДНК бактерии-хозяина из просветленного лизата ) можно осуществлять в препаративном варианте на колонке оксиапатита и без участия бромистого этидия, но в присутствии 8 М мочевины, что обеспечивает сохранение однонитевой структуры РНК. Окси-апатит (1 г на 1 л лизата бактерий) суспендировали в 0,2 М Na-фосфатном буфере (pH 6,8) с добавлением до 8 М мочевины и заполняли им широкую колонку. Освобожденный от ДНК хозяина лизат без какой-либо дополнительной очистки разбавляли в соотношении 9 1 0,27 М Na-фосфатным буфером (pH 6,8) с 9 М мочевиной и 0,9% ДДС-Na и вносили в колонку. Ее промывали сначала тем же раствором, но без ДДС-Na, потом 0,01 М Na-фосфатным буфером без мочевины (при этой промывке сорбент один раз взмучивали и снова давали ему осесть). Все белки и РНК выходили из колонки в ходе промывок. Плазмидную ДНК элюировали 0,3 М Na-фосфатным буфером. По данным авторов, ее выход сильно варьировал от одной партии оксиапатита к другой. Из больших объемов бактериальных лизатов все нуклеиновые кислоты целесообразно сначала осадить этанолом. Показано, что разрывы в плазмидной ДНК в ходе очистки на оксиапатите не появляются [ olman et al., [c.239]

Интенсивность окраски бромистым этидием зависит от размеров рестриктов зоны крупных рестриктов удается выявить при наличии 30—50 нг в полосе. Для выявления мелких рестриктов необходимо иметь 200—500 нг фрагмента ДНК в каждой полосе. Поэтому для обнаружения всех фрагментов, образующихся при обработке ДНК фага "К рестриктазой Hind П1, необходимо наносить на гель образцы с минимальным (0,3—0,5 мкг) и максимальным (2—5 мкг) количеством ДНК. В последнем случае удается выявить все зоны рестриктов, при этом полосы крупных рестриктов выявляются в виде сильно перегруженных зон, а полосы средних и мелких по размеру рестриктов — в виде тонких, четко разделенных полос. [c.176]

Рис. 15.2. Наборы полос, получаемые при обработке плазмид Ар из разных энтеробактерий рестриктазой Hin [8]. Обработку и электрофорез проводили, как описано в разд. 15.3 2. Гель окрашивали бромистым этидием. Картина люминесценции, возникающая в результате иитеркаляции красителя при освещении ультрафиолетом, сфотографирована на плеику Поляроид .

Используя праймеры, фланкирующие сайт vnl, амплифицируют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК (рис. 9.9, А). Амплифицированный фрагмент обрабатывают vnl, продукты рестрикции разделяют с помощью гель-электрофореза и окрашивают их бромистым этидием. При наличии vnl-сайта на электрофореграмме появляется специфический набор полос (рис. 9.9, В), отличный от такового [c.195]

С использованием флуоресценции бромистого этидия предложен метод анализов разрывов и соединений в кольцевой ДНК [45]. Подобный метод с использованием люминесценции акридинового оранжевого (по длительности люминесценции или но соотношению интенсивностей зеленой и красной люминесценции) применяется для оценки состояния ДНК в растворе [46, 47]. В цитологии метод анализа хроматина но люминесценции акридинового оранжевого был предложен Мейселем [48] и Берталанффи [29]. Затем Риглер [49] разработал количественный метод определения строения нуклеиновых кислот с помош ью микрофлуориметрии акридинового оранжевого. В настоящее время акридиновый оранжевый является наиболее популярным флуорохромом для анализа соотношения ДНК и РНК в одной клетке и для изучения активации хроматина нри различных процессах [50]. [c.296]

А—электрофореграмма продуктов расщепления ДНК 1-бактериофагов H Gt (t, 3) и Н Оз (2, 4), содержащих встроенные фрагменты гена -глобина человека длиной 15 000 пар оснований, рестриктазами E oRl (1, 2) и Pst 1 (3, 4). Электрофорез проводили в пластинках 0,8%-ного агарозного геля в 40 мМ трис-буфере, содержащем 5 мМ ацетат натрия и 1 мМ ЭДТА и доведенном до pH 7.4 путем добавления уксусной кислоты. Для обнаружения полос гель обрабатывали раствором бромистого этидия (0,5 мкг мл) и фотографировали при УФ-освещении. [c.186]

В природных кольцевых отрицательно суперспирализованных ДНК интеркаляция бромистого этидия сначала удаляет отрицательные супервитки и затем вводит положительные супервитки. По количеству бромистого этидия, необходимого для нулевой суперспирализации, измеряют исходную плотность отрицательных супервитков. [c.348]

Степень суперспирализации этого компактного тела можно измерить по его реакции на бромистый этидий (гл. 28), Полученные данные свидетельствуют о суше-ствовании примерно одного отрицательного супервитка на 200 п. н. Эти супервитки можно удалить, вводя одноцепочечные разрезы с помощью ДНКазы нуклеосомы при этом остаются. Следовательно, суперспирализация, очевидно, обусловлена расположением нуклеосом и должна заключаться в скручивании линкеров между отдельными нуклеосомами. Для полной релаксации супервитков нужен один одноцепочечный разрез на каждые 85 т. п. н. Таким образом, средняя длина замкнутой ДНК равна [c.374]

С использованием полинуклеотид-киназы осуществляют перенос от [у = = "Р] АТР к 5 -концу интактной молекулы ДНК фага X. Затем необходимо провести полное расщепление меченой ДНК рестриктазой Яш dlll. Рестрикщсонные фрагменты разделяют с помощью электрофореза и идентифицируют положение каждого из фрагментов после окрашивания геля в растворе бромистого этидия. После этого гель накладывают на рентгеновскую пленку для идентификации двух меченых концевых фрагментов с помощью радиоавтографии. [c.282]

При добавлении в среду таких веществ, как акридиновые красители, бромистый этидий, додецилсульфат натрия и новобиоцин, а также при повыщении температуры из бактериальных клеток могут высвобождаться молекулы плазмидной ДНК (излечивание бактерий) [20]. Плазмидные молекулы, существующие как независимо реплицирующиеся кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, удаляются под действием этих агентов либо из-за нарущения их репликации (вещества акридинового ряда, бромистый этидий и новобиоцин), либо в результате изменения места их прикрепления к мембране (в присутствии додецилсульфата натрия и при повышенной температуре). Поскольку плазмидная ДНК играет важную роль в качестве переносчика генетических факторов устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам, а также факторов, детерминирующих антибактериальные агенты и сложные метаболические функции, методы получения бесплазмидных штаммов вызывают большой интерес у исследователей, занимающихся генетикой бактерий. [c.24]

Этим методом от основной массы хромосомной ДНК и клеточных обломков отделяется около 95% плазмид. Обогащенную плазмидами надосадочную фракцию (3,2 мл) подвергают дальнейшей очистке и концентри-рованию центрифугированием в градиенте плотности хлористого ц.езия в присутствии бромистого этидия (це-зий-этидиевый градиент разд. 15.3.3). [c.131]

Молекулы плазмидной ДНК, полученные из клеток бактерий, представляют собой двухцепочечные ковалентно замкнутые кольцевые структуры, не имеющие свободного конца, вокруг которого они могли бы раскручиваться. Бромистый этидий, относящийся к ряду фенатридиновых красителей, связывается с ДНК и РНК и тормозит функционирование нуклеиновых кислот [5, 15]. Клетки лизируют и лизаты наносят на градиенты хлористого цезия, содержащие бромистый этидий. При высокоскоростном центрифугировании ДНК седименти- [c.145]

Рис. 15.3. Результат центрифугирования бактериального лизата, полученного при добавлении тритона Х-100, в цезий-этидиевом градиенте. При освещении ближним ультрафиолетовым светом видны две полосы люминесценции интеркалировавшего в ДНК бромистого этидия. Верхняя полоса соответствует хромосомной ДНК, нижняя — плазмидной ДНК.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология