Раствор используемые при картировании

Денатурациоиное картирование близко к картированию вторичной структуры. Последнее пока находит применение в основном при исследовании РНК, но может с успехом использоваться и для одиночных цепей ДНК. При картировании вторичной структуры выявляются не самые первые выплавляемые области, а те участки, которые плавятся в последнюю очередь. Они выглядят как шпильки или более сложные ветвистые структуры на фоне расплавленной одноцепочечной молекулы РНК. В идеальном случае наиболее стабильная область вторичной структуры РНК должна соответствовать наиболее стабильной области двойной спирали ДНК, которая кодирует эту РНК. Температура — не совсем подходящий параметр для картирования вторичной структуры вследствие кооперативности последних этапов температурного плавления и из-за слишком сильной реакционной способности формальдегида при температурах выше Т . Более подходящими оказываются денатурирующие органические растворители, и большинство работ было выполнено с использованием водных растворов формамида. [c.292]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология