Клонотека генов

Поиск последовательностей в клонотеках генов [c.162]

Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или какую-либо известную его часть. При этом репрезентативная клонотека должна заключать в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов изучаемого генома. Аналогичный по смыслу и широко распространившийся в русскоязычной литературе термин библиотека генов или библиотека последовательностей, который представляет собой буквальный перевод английского термина library , нельзя считать удачным, поскольку набор нуклеотидных или аминокислотных последовательностей не имеет никакого отношения к книгохранилищу. [c.155]

Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов - РНК, белков или ферментативной активности, т.е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например, цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует самую высокую эффективность, так как позволяет в одно касание освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов. [c.162]

Любой индивидуальный ген занимает лишь небольшую часть генома живого организма. В то же время размер генома даже наиболее просто организованных бактерий в среднем составляет 2-106 П.О., а суммарный размер молекул ДНК, составляющих гаплоидный геном человека и высших животных, по крайней мере, на три порядка больше. Из этого следует, что уникальные гены, представленные в гаплоидном геноме только одной копией, затеряны среди других последовательностей генома, и для работы с индивидуальными рекомбинантными ДНК требуется их очистка от ненужного генетического материала. Такая задача в генной инженерии решается через создание репрезентативных (представительных) клонотек последовательностей нуклеотидов ДНК или, иначе говоря, клонотек генов. [c.155]

Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд олигонуклеотидных зондов и использовать их для скрининга клонотеки генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК, так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная длина которых может значительно (на два-три порядка) превышать таковую значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек особенно остро встает вопрос об их репрезентативности, поскольку внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК, гибридизующей-ся с упомянутыми выше олигонуклеотидными зондами, можно [c.251]

Получение клонотек генов [c.155]

Чем короче фрагменты, используемые для получения клонотек генов, и чем сложнее исследуемый геном, тем большее число клонов необходимо получить, чтобы клонотека была полной. Например, для того чтобы создать геномную клонотеку бактерий из фрагментов ДНК длиной в 20 т.п.о., в которой любая последовательность была бы представлена с вероятностью 99%, необходимо иметь 460 клонов, тогда как для млекопитающих это число возрастает до 600 ООО, а для покрытосеменных растений оно еще в -10 раз больше. Отсюда следует, что в случае получения репрезентативных клонотек генов бактерий для решения такой задачи вполне достаточно плазмидных векторов, несмотря на их небольшую емкость. В то же время использование плазмид для создания полных клонотек генов млекопитающих или растений совершенно бесперспективно, так как потребовало бы поддержания в клонотеке огромного количества клонов, многие из которых с большой вероятностью могут быть утрачены. [c.157]

Для более детальной характеристики этих элементов из клонотеки генов хромосомы 19 человека были выделены и охарактеризованы рекомби- [c.174]

Оба обсуждаемых метода часто используются комбинировано, т. е. для обогащения клонотеки генами метилазы используют биохимический метод селекции, а на следующем этапе отбирают клоны, устойчивые к фагу [22, 139, 200]. [c.187]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

На рис. 9 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам. На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами ВатШ и Smal, причем рестриктаза Smal расщепляет ДНК с образованием тупых концов. В результате образуются два плеча космидного вектора, содержащих область начала репликации ori, используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам - ампициллину (Атр ) и канамицину (КапО, а также два со -сайта хромосомы бактериофага X. Параллельно со всеми необходимыми предосторожностями получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать. [c.156]

На вышеприведенном частном примере был рассмотрен один из подходов к конструированию клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора, который иллюстрирует все основные этапы получения клонотек генов с применением и других векторов, плазмидных или фаговых [227, 228]. Во всех случаях для получения репрезентативных клонотек генов следует по-itiHHTb о необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной ДНК, чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были представлены равновероятно, роме того, размеры образуемых фрагментов ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать фрагменты ДНК длиной 35-45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых векторах типа haron и плазмидах эти размеры должны составлять соответственно 20-24 и 1,5-3,0 т.п.о. [c.157]

Выше были рассмотрены условия, которые необходимо соблюдать для получения репрезентативных клонотек геномной ДНК. Однако во многих случаях не возникает необходимости работать с полными клонотеками генов, и исследователи ограничи- [c.161]

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рас-севают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры [235, 236]. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. [c.163]

Использование антител для отбора клонов в экспрессирующих клонотеках. Получение клонотеки генов или кДНК с использованием экспрессирующих векторов дает ряд преимуществ в их последующем отборе. В этом случае, если 5-концевая часть клонируемого гена находится близко от промотора вектора или его кодирующая часть соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном через последовательность, кодирующую часть другого белка, например, 3-галактозидазы, то в бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если же рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают иммунохимическими методами. Отбор нужных клонов может проводиться и с помощью чисто генетических методов с использованием специально сконструированных векторных плазмид. [c.166]

Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, клонотеки пептидов, полученные генно-ин-женерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Недавно сделанные наблюдения позволяют рассматривать клонотеку пептидов одновременно и в качестве клонотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образующиеся между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд-рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую клонотеку пептидов - как клонотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов. [c.338]

Из клонотеки генов хромосомы 19 клонировали рекомбинантные фаги, содержащие последовательности, сходные с генами tatjrev. Анализ этих последовательностей показал, что в отдельных из них содержится по несколько фрагментов, имеющих гомологию с зондом. Это свидетельствует о соседст-вовании в геноме человека некоторых toi/rev-подобных элементов. [c.173]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология