Дрожжи векторы

Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. соИ, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки. В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую [c.150]

Книга охватывает все таксоны бактерий и посвящена проблемам теоретической и прикладной бактериологии. Поскольку в природе преобладают сапрофитные формы, паразитические и патогенные бактерии отдельно не рассматриваются. Не обсуждаются также специальные методы прикладных областей микробиологии, равно как и не делается попытка охватить всю микробиологию. Вирусы упоминаются только в связи с бактериофагами, используемыми в качестве векторов в процессе переноса генов, водоросли — только в связи с цианобактериями (сине-зелеными водорослями) дрожжи, плесневые грибы и простейшие упоминаются лишь вскользь. [c.7]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в . соН, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. соИ и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вьщеленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозя-ину легко тестируемый признак. [c.124]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Для экспрессии клонированных эукариотических генов интенсивно используют обычные дрожжи Sa haromy es erevisiae. Тому есть несколько причин. Во-первых, это одноклеточный организм, генетика и физиология которого детально изучены и который можно выращивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промышленных биореакторах. Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные, так называемые 2 мкм-плазмиды. В-третьих, в клетках [c.136]

Все это заставило ученых исследовать возможность получения гетерологичных белков с помощью других видов дрожжей и с использованием эукариотических систем. В частности, изучались соответствуюшие векторы — системы экспрессии, содержащие видоспецифичные регуляторные последовательности транскрипции и трансляции, возможность трансформации этих видов и получения высокого выхода белков и возможность крупномасштабного культивирования организма-хозяина. В качестве альтернативы S. erevisiae можно использовать Kluyveromy es la tis, дрожжи, которые применяют для промышленного производства лактозы [c.140]

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, использовались дрожжи S. erevisiae. Их генетика хорошо изучена, а кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах. Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью S. erevisiae было получено множество самых разных аутентичных белков. Однако многие рекомбинантные белки в этой системе не подвергались носттрансляционной модификации, к тому же их выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбинантных белков. [c.154]

Челночный вектор (Shuttle ve tor) Плазмидная ДНК, способная реплицироваться в клетках двух разных типов (например, в Е.соИ и ютетках дрожжей). [c.564]

Нередко возникает задача ввести ген в клетки эукариот, например в дрожжевые клетки, в которых могут нарабатываться белки, прошедшие после их образования необходимые стадии модификации, несвойственные прокариотическим клеткам. Для этой цели используют специальные, так называемые челночные, векторы, которые могут автономтю размножаться как в прокариотических, так и в эукариотических клетках, например в Е.соН и дрожжах. В эукариотические клетки плазмиды вводят на заключительных стадиях, поскапьку многие предварительные этапы клонирования существенно проще проводить в кле гках прокариот. [c.304]

Обычно векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, которые мог т существовать и в Е. OU. и в той клетке-хозяине. для которой они предназначены. Это достигается созданием гибридных векторов, содержащих реп-ликон какой-либо из плазмид Е. oli и требуемый репликон, например плазмиды В. subtilis или дрожжей, что позволяет проводить первоначальное клонирование и отбор требуемых генов в хорошо изученной системе Е. oli, а затем уже вводить выделенные рекомбинантные плазмиды в новый организм. [c.439]

Экспрессионные векторы. Их используют для анализа конкретных последовательностей генов и их белковых продуктов, а также наработки конкретного белка. Существует огромное количество экспрессионных систем, особенно для прокариотических организмов. Есть также векторы для экспрессии генов в клетках дрожжей, растений и млекопитающих. Экспрессионные векторы для эукариотических организмов всегда содержат так называемую экспрессионную кассету, состоящую из промотора, способного работать в данном организме и сайта полиаденилирования. [c.36]

YA -векторы, которые также используются для клонирования больших фрагментов ДНК, представляют собой искусственную дрожжевую минихромосому. YA -вектор содержит центромеру, теломеры и точку начала репликации. В такой вектор можно встроить фрагменты чужеродной ДНК размером более 100 т. н. п., и такая минихромосома, введенная в клетки дрожжей, будет реплицироваться и вести себя аналогично другим дрожжевым хромосомам при митотическом делении. [c.41]

Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот, Е. oli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков эукариотических организмов. Поэтому разработаны методы получения векторов для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных эукариот. Эти клонирующие векторы получают из репликонов дрожжевых клеток, так называемых 2 л-плазмид. Точки начала репликации этих векторов взяты у плазмид 2 л и у pBR322, в результате чего они могут реплицироваться как в дрожжевых клетках, так и в . соИ. Примером использования дрожжей для синтеза белков посредством клонирования генов эукариот может служить осуществленный таким образом синтез интерферона человека (интерферон-белок, обладающий противовирусным действием в клетках человека и, возможно, противоопухолевым действием вообще). [c.290]

Эукариотическая клетка содержит тысячи различных белков, но значительное большинство этих белков, и в том числе наиболее интересньге, присутствуют в небольшом количестве. Некоторые из них иногда чрезвычайно трудно, если не невозможно, получить в чистом вгвде в количестве, превышающем несколько микрограмм. Разработка методов рекомбинантных ДНК сделала доступньгми любые клеточные белки (включая минорные белки) в больших количествах Для этого клонируют ген нужного белка и затем встраивают его в специальную плазмиду, именуемую клонирующим вектором. Этот вектор сконструирован таким образом, что будучи введенным в бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих соответствующего типа, он обеспечивает крупномасштабный синтез этого белка. Таким образом, если раньше для летальных структурных или функциональных исследований были достугшьг лишь немногие белки, в настоящее время практически все белки клетки могут быть предметом подобных исследований. [c.243]

Конструирование рекомбинантных молекул иа базе подобных векторов, т. е. введение в них гетерологичных структурных генов, осуществляется с помощью стандартных молекулярногенетических процедур [8, 9]. Аммерер [26] опубликовал интересную методическую статью, посвященную экспрессии в дрожжах генов с использованием промотора add. Эффективность лигиро- [c.218]

Выбор штамма-хозяина диктуется типом векторной плазмиды, которую предполагается использовать для трансформации хозяин должен нести мутацию в гене, копия которого б плазмиде выполняет роль селективного маркера. Так, если доминантным селективным маркером служит плазмидный ген сир1 (обеспечивающий устойчивость к ионам меди), перед исследователем открывается широкий выбор штаммов-хозяев (гаплоидных, диплоидных или даже не охарактеризованных пивных дрожжей), поскольку большинство из них чувствительно к ионам меди, а это единственное необходимое условие их пригодности для работы с данным вектором. [c.220]

В первую очередь необходимо иметь хорошо отработанную систему хозяин — вектор. Под вектором понимается, как правило, небольшая молекула ДНК, способная к автономной репликации в определенном микроорганизме. Это может быть бактериофаг или плазмида. Естественно, необходимо иметь эффектинп1>1Й способ введения векторной и рекомбинантной молекулы в микроорганизм. Векторные молекулы должны обладать рядом свойств, позволяющих удобное введение чужеродной ДНК и ее последующую экспрессию. В настоящее время векторные системы очень хорошо разработаны для такой бактерии, как Es heri hia oli. Задача прикладной микробиологии — освоение систем хозяин — вектор для промышленных микроорганизмов бацилл, псевдомонад, актиномицетов, дрожжей и др. Успехи в этой области суммированы в обзоре Успехи микробиологии за 1983 г. [c.96]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология