Гибридизация с клонированным фрагментом

Недавно был получен вектор, с помощью которого можно конструировать искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) [9]. Это открытие сулит переворот в картировании появляется возможность клонировать фрагменты ДНК, на порядок превышающие по размерам космидные вставки. Вероятно также, что соответствующие геномные библиотеки окажутся более представительными. Метод отпечатков пальцев (фингерпринт) пока пригоден лишь для маленьких YA , но, используя гибридизацию, можно будет присоединять к космидам и большие фрагменты. Скорее всего в будущем для картирования генома будет применяться техника подбора пар, специально разработанная для YA . [c.33]

Вам нужно клонировать и экспрессировать фрагмент ДНК, кодирующий интерферон человека. У вас нет нужного ДНК-зонда для гибридизации, но вам удалось выделить линию клеток человека, в которых можно индуцировать синтез интерферона с интенсивностью, превышающей фоновую примерно в 100 раз. Какую стратегию клонирования и экспрессии этой ДНК вы выберете [c.226]

Если полосы не соответствуют ни одному из приведенных выше критериев, скорее всего онн состоят из перестроенных фрагментов и их анализ методом блоттинг-гибридизации по-Саузерну может оказаться затруднительным. Для дальнейшего изучения такие полосы можно одновременно расщепить двумя рестриктазами, кроме того, использовать короткие-специфические пробы и рестриктазы, узнающие последовательности из четырех нуклеотидов. Если результат и в этом случае трудно интерпретировать, то эти последовательности следует клонировать и определить в них порядок нуклеотидов. [c.316]

Использование YA для получения клонотек нуклеотидных последовательностей. При создании искусственных хромосом дрожжей in vitro в среднем удается клонировать фрагменты ДНК длиной 300 т.п.о. Однако с помощью гомологичной рекомбинации, проводимой непосредственно в клетках дрожжей, можно получать вышеупомянутые вставки в несколько млн п.о. Для реализации полной емкости вектора используют предварительно полученные YA -конструкции, в которых клонированы частично перекрывающиеся последовательности. Для обнаружения перекрывающихся клонов используют рестрикционное картирование с гибридизацией по Саузерну, метод прогулки по хромосоме и ряд других стандартных методов исследования генома, которые будут рассмотрены во втором томе этой книги. После обнаружения таких перекрывающихся клонов проводят скрещивание гаплоидных клеток, содержащих требуемые YA , в полученных диплоидных штаммах индуцируют мейоз, при котором с высокой частотой возникают требуемые рекомбинантные YA с протяженными непрерывными последовательностями - контигами - исследуемого генома. Для предотвращения образования в результате рекомбинации дицент-рических и ацентрических YA , которые нестабильны, объединяемые вставки должны быть клонированы в одной и той же 5 3 -ориентации по отношению к маркерам вектора. После завершения клетками мейотических делений и споруляции в спорах обнаруживают требуемые рекомбинанты, конечная длина которых после проведения серии последовательных скрещиваний может превышать 2 млн п.о. [105, в]. [c.91]

Иногда для достижения поставленной цели применяется метод поэтапного клонирования. На первом этапе клонируется ген метилазы. Для определения предположительной локализации рестриктазного гена проводится физическое картирование последовательностей донорной ДНК, окружающих ген метилазы. В качестве зонда для блот-гибридизации используется ген метилазы [147, 148] или синтетические олигонуклеотиды [124]. Донорная ДНК перед лигированием обрабатывается отобранными таким образом рестриктазами с целью вырезания фрагмента предположительно содержащего не только ген метилазы, но и рестриктазы. Однако не всегда реализация такого подхода дает положительный результат. Поучителен в этом отношении пример по клонированию генов гт Dde I [124]. В этом случае на первом этапе удалось клонировать только ген метилазы. Впоследствии это нашло объяснение в том, что при получении банка генов провели исчерпывающий гидролиз донорной ДНК рестриктазой Hind ni, которая как потом оказалось имеет сайт в гене рестриктазы. Для картирования генов гт Dde I методом блот-гиб-ридизации в качестве молекулярных зондов применили метилазный ген и смесь синтетических олигонуклеотидов, имеющих гомологию с геном рестриктазы. Структура олигонуклеотидов была предсказана на основе анализа аминокислотной последовательности N конца рестриктазы, выделенной в гомогенном состоянии из природного продуцента. В результате проведенных исследований было определено, что гены гт Dde I расположены на Pst I фрагменте хромосомной ДНК величиной 4,8 кб. Однако попытки клонировать этот фрагмент не дали [c.187]

ИХ рестриктазами, разделяются электрофоретически на агарозе или полиакриламидном геле. Специфические фрагменты ДНК обнаруживаются затем путем гибридизации с помощью проб радиоактивно меченной нуклеиновой кислоты. Гибридизацию проводят после того, как фрагменты нуклеиновой кислоты будут физически перенесены с геля на мембранный фильтр (процедура, получивщая название перенос пятен , англ. blotting). Перенос производится таким образом, чтобы зафиксировать расположение пятен, которое было на геле. Это позволяет локализовать сегменты ДНК, комплементарные выбранной радиоактивной нуклеиновой кислоте (обычно РНК). Если для определенного белка радиоактивная РНК является информационной, то метод позволяет выделить ген этого белка. После идентификации гена его можно связать с соответствующим вектором клонирования и клонировать выращиванием в подходящем бактериальном штамме. [c.321]

Наличие очищенных индивидуальных мРНК открывает возможности для ряда интересных экспериментов. Во-первых, с помощью метода гибридизации соответствующей мРНК (или комплементарной ей ДНК-копии) с хромосомной ДНК можно определить число определенных генов в геноме. Во-вторых, можно идентифицировать фрагменты ДНК, содержащие данный ген, гибридизуя их с мРНК. Затем эти фрагменты можно клонировать (разд. 31.11), чтобы получить сам ген и прилегающие к нему участки хромосомы в большом коли- [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология