Векторная Галактозидаза

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

Использование антител для отбора клонов в экспрессирующих клонотеках. Получение клонотеки генов или кДНК с использованием экспрессирующих векторов дает ряд преимуществ в их последующем отборе. В этом случае, если 5-концевая часть клонируемого гена находится близко от промотора вектора или его кодирующая часть соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном через последовательность, кодирующую часть другого белка, например, 3-галактозидазы, то в бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если же рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают иммунохимическими методами. Отбор нужных клонов может проводиться и с помощью чисто генетических методов с использованием специально сконструированных векторных плазмид. [c.166]

Галактозидазу можно выделить из клеток Е. соИ в гомогенном виде в один этап с помощью аффинной хроматографии на л-амино-фенил- - -тиогалактозид-аггфозе. Поэтому при создании векторных систем, предназначенных для синтеза чужеродных белков в составе химер с /З-галактозидазой, важно было сохранить большую часть /3-галактозидазы в неповрежденном виде, что обеспечило бы специфичность хроматографической очистки химерных белков. Вьщеленные таким образом химерные белки при иммунизации кроликов вызывают наработку в организме животных антител как на /З-га-лактозидазу, так и на целевой белок. [c.123]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология