Рекомбинантная плазмида

Рис. 5.15. Схема рекомбинантной плазмиды, обусловливающей синтез интерферона человека в Е. соИ

Опишите способы введения рекомбинантных плазмид в грамотрицательную бактерию, например в Е. соН. [c.79]

После конструирования вектора рекомбинантные плазмиды смешивают с клетками для трансформации. Например, клетки кишечной палочки со встроенным вектором выращивают на питательной среде, и в процессе этого роста образуются рекомбинантные ДНК, содержащие гены из разных организмов. Поскольку при этом образуются сходные молекулы (клоны), такой процесс называется клонированием. Далее клонированную ДНК вводят в клетки, где и происходит экспрессия генов, т.е. процессы транскрипции и трансляции с образованием необходимого белка. [c.61]

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. соИ НЕ 101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом X. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа X, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [c.248]

Как влияет присутствие в клетке рекомбинантной плазмиды на ее рост [c.370]

Рекомбинантная плазмида с фрагментом 11 [c.375]

Рекомбинантная плазмида с фрагментом I [c.375]

Значение рекомбинантных плазмид в связи с проблемой устойчивых хлорзамещенных пестицидов описано в главах 9 и 10. Использование такой технологии необходимо в связи с загрязнением почвы различными пестицидами и химикалиями. Многие из них кумулятивны, и даже если их применяют в относительно малых концентрациях, они могут накапливаться [c.344]

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в . соН, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. соИ и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вьщеленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозя-ину легко тестируемый признак. [c.124]

Процедура вьщеления ДНК в клетки дрожжей довольно проста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая ин( а-ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компонент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку-хозяина придают ей этот недостаюший признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки подобно В. subtilis секретируют большое количество белка во внеклеточную среду, что используется также для секреции чужеродных белков, например интерферона человека (с. 43). [c.125]

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соедршенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК -клетками. Клетки ТК легко отличаются от клеток TK , поскольку способны расти на средах с ами-ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных бьши использовапы гибриды бактериальных плазмвд с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. соИ и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК -клетки. Анализ мето- [c.125]

Метаболическая перегрузка может привести к разнообразным изменениям в физиологии и функционировании хозяйской клетки. Одно из наиболее частых - снижение скорости роста клеток после введения чужеродной ДНК. Так, клетки, содержащие плазмиду, растут медленнее, чем нетрансформированные, не содержащие плазмид (табл. 6.6), что часто сопровождается утратой рекомбинантной плазмиды. Иногда метаболическая перегрузка приводит к тому, что под давлением отбора из плазмиды де-летируется рекомбинантный ген или его часть. [c.127]

Рис. 24 Схема нспольэовання плазмиды рВН.122 для отбора клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды.

Основные этапы генно-инженерного синтеза соматостатина показаны на рис. 5.14. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 Е. соН вблизи конца гена, кодирующего фермент -галакгозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После выделения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибрид- [c.137]

Промежуточный и бинарный векторы. Эти векторы конструируются на основе Ti-плазмид. Промежуточный вектор получают путем ряда сложных операций. Сначала Т-область с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды, вставляют в вектор для клонирования в клетке Е. oli и размножают. Затем внутрь Т-области встраивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки А. tumefa iens, несущие полную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками Т-область рекомбинантной плазмиды, содержащая чужеродный ген, включается в Ti-плазмиду клетки хозяина, заместив в ней нормальную Т-область. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенньпли генами, заражают растения, где эти гены встраиваются в геном растительной клетки. [c.147]

Более того, имеются основания утверждать, что, по крайней мере, самые фундаментальные механизмы сигнального пептид-мембранного узнавания и последующего внутримембранного пептидного отщепления являются общими для эукариот и прокариот. В самом деле, бактерии, несущие рекомбинантные плазмиды с генами эукариотических секретируемых белков, могут синтезировать эти белки и эффективно секретировать их сквозь цитоплазматическую мембрану из клетки, специфически отщепляя амино-терми-нальный сигнальный сегмент. Например, крысиный препроинсулин, синтезируемый в Е. соИ, правильно процессируется в проинсулин, и последний секретируется из бактериальной цитоплазмы в периплазматическое пространство. [c.280]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Рекомбинантные плазмиды упаковали в частицы фага X, ввели в Е. соИ, а затем перенесли в клетки Nod -mTaMMa R. meliloti при помощи конъюгации. Вектор содержал ген устойчивости к тетрациклину, который можно было использовать как селективный маркер и в случае Е. соИ, и в случае R. meliloti. [c.316]

Время ферментации в непрерывном режиме иногда составляет 500—1000 ч, при этом некоторые клетки могут потерять рекомбинантные плазмиды. Клетки, не несушие плазмид, обычно расходуют меньше энергии и делятся быстрее, чем те, которые содержат плазмиду, поэтому со временем выход продукта может снижаться из-за уменьшения числа клеток, способных его синтезировать. Эту проблему можно было бы решить, интегрировав клонированный ген в геном организма хозяина. [c.354]

Впервые возможность переноса ДНК при помощи микроинъекций в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыщи была проиллюстрирована Дж. Гордоном и др. В этом эксперименте в несколько сотен оплодотворенных яйцеклеток инъецировали плазмидный вектор pBR322, содержащий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) и часть генома обезьяньего вируса 40 (SV40). Из 78 потомков, рожденных приемными матерями, два содержали плазмидную ДНК. Авторы сделали вывод, что эти данные свидетельствуют о возможности использования рекомбинантных плазмид в качестве вектора для введения чужеродных генов непосредственно в эмбрионы мыщей, которые сохраняют эти гены в ходе развития . К сожалению, плаз- [c.428]

Рекомбинантная плазмида (Re ombinant plasmid) Плазмида, измененная методами генной инженерии. Состоит из участков разных плазмид либо содержит сегменты ДНК других организмов. [c.558]

Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

Обычно векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, которые мог т существовать и в Е. OU. и в той клетке-хозяине. для которой они предназначены. Это достигается созданием гибридных векторов, содержащих реп-ликон какой-либо из плазмид Е. oli и требуемый репликон, например плазмиды В. subtilis или дрожжей, что позволяет проводить первоначальное клонирование и отбор требуемых генов в хорошо изученной системе Е. oli, а затем уже вводить выделенные рекомбинантные плазмиды в новый организм. [c.439]

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название шотган (от англ. shotgun-дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды Е. соИ, раскрытые (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом. Одна из таких процедур описана в разд. 30.17. [c.983]

Этот ПОДХОД был использован при клонировании гена соматостатина-пт-тщного гормона (14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и гормона роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена 3-галактози-дазы. Два связанных между собой гена были встроены в плазмиду Е. соИ, и полученная рекомбинантная плазмида была введена в клетки Е. oli. В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом Р-галактозидазы и соматостатина. Такая молекула, представляющая собой гибрид собственного белка Е. oli и белка позвоночного организма, называется химерным белком. Гибрид р-галактозидазы и соматостатина расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. [c.988]

Идентификация искомых клонов занимает иногда многое времени. Если же клонирование гена проведено, выявить сходные гены в банках кДНК относительно несложно, если применить метод Грюнштейна и Хогнесса. В этом случае колонии бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверхность питательной среды. Затем бактериальные клетки разрушают, а высвободившуюся ДНК денатурируют. При этом она остается связанной с фильтром. Далее на фильтр наносят радиоактивный зонд — денатурированную ДНК или РНК, которая связывается с гомологичной или частично гомологичной бактериальной ДНК- Избыток радиоактивных молекул зонда,, которые не связались специфически с гомологичной ДНК, удаляют промыванием и выявляют лизированные колонии, связавшие зонд, методом радиоавтографии. Бактерии, для которых наблюдалась положительная реакция в этом тесте, можно выделить из дубликата — реплики набора колоний. [c.316]

Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид основаны на экспрессии включенного в них гена. При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности. Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизиро-ванных бактерий связываются с антителами на диске. Положение антигенов, адсорбированных на диске, определяют с помощью радиоавтографии. [c.316]

Полученные in vitro рекомбинантные плазмиды необходимо перенести в подходящую клетку-хозяина, природа которой и определяет особенности способа трансформации. Так, клетки [c.318]

Введение чужеродного гена в клетки организма-продуцента — это отнюдь не единственный генно-инженерный способ конструирования новых штаммов. Иногда оказывается полезным клонирование собственных генов организма. Так, если известно, что определенная ферментативная реакция лимитирует скорость какого-то метаболитического процесса, то введение многих копий соответствующего гена в рекомбинантные плазмиды может ликвидировать это узкое место благодаря образованию большего числа молекул фермента. Главной областью применения самоклонирования , видимо, может стать направленный мутагенез. При обычном методе получения новых штаммов с помощью мутагенеза и отбора действию мутагена подвергается весь геном организма-продуцента. При этом, естественно, не гарантируется, что полезные мутации произойдут именно в интересующих нас генах. Мутируют также и другие гены, и некоторые из таких мутаций неблагоприятно повлияют на жизнеспособность организма-продуцента. Если же провести клонирование нужных генов, то их обработку мутагеном можно провести in vitro, а затем вернуть эти гены в организм, Это гарантирует получение только желаемых мутаций. [c.321]

С помощью этого метода за короткий срок удалось установить полную нуклеотидную последовательность ДНК SV 40, рекомбинантной плазмиды pBR322 и многих других последовательностей ДНК. Однако секвенирование методом Максама-Гилберта имеет ряд недостатков, связанных с длительностью и значительной трудоемкостью процедур. В настоящее время на основе секвенирования с помощью химической деградации разработаны усовершенствованные и быстрые методы определения нуклеотидной последовательности, в том числе твердофазное секвенирование и секвенирование с использованием обращенно-фазовой хроматографии. [c.30]

Однако ни один из этих оболочечных белков, успешно синтезируемых на матрице рекомбинантных плазмид в бактериальной клетке, не стал, и вряд ли в ближайшем будущем станет вакциной субъединичного типа. Это связано с тем, что вирусные белки, синтезированные в бактериальной системе, уступают по иммуногенностн и по выходу продуктов эукариотического синтеза. Сегодня широко применяется противоящурная [c.252]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология