Спасение маркера

Клонированный в составе плазмиды ген тимидинкиназы вируса простого герпеса был использован при разработке нового подхода к конструированию гибридных вирусов, которые имеют крупный геном и вследствие этого к ним неприменимы методы рекомбинации молекул ДНК in vitro. Б. Ройзман с сотрудниками в 1978-1979 гг. показали, что при совместной трансфекции клеток молекулами ДНК штамма HSV-1, имеющего термочувствительную мутацию, и определенным рестрикционным фрагментом ДНК вируса дикого типа удается осуществить так называемое спасение маркера. Оно происходит при рекомбинации in vivo фрагмента вирусного генома с мутантной ДНК вируса, в результате чего мутантный локус замещается локусом дикого типа. [c.386]

Таблица 9.6. Клонирование провирусной ДНК с использованием слияния инфицированных клеток с os-клетками и феномене спасения маркера [22

Наконец, у вирусов описано явление неспецифической репарации — множественной и перекрестной реактивации, прямо ие связанной с системой темновой репарации. Обнаруженная Лурия множественная реактивация заключается в восстановлении жизнеспособности фагов при инфицировании клетки большим числом убитых ультрафиолетовым светом фагов, когда из инактивированных фаговых частиц образуется полноценное потомство. Под перекрестной реактивацией понимают восстановление жизнеспособности убитого фага при множественном инфицировании клетки этим фагом и другим, необлученным, отличающимся от первого своим геномом. Это явление нередко называют спасением маркеров . Ё основе множественной и перекрестной реактивации лежит реконструкция интактной ДНК из неповрежденных фрагментов нескольких молекул ДНК фагов в ходе генетической комплементации и рекомби нации. [c.304]

Методика олигоггуклеотид-направ-ленного мутагенеза (сайт-спенифи-ческого мутагенеза) была разработана в основном в лаборатории М. Смита как модификация метода спасения маркера . При спасении маркера мутацию в фаговой ДНК устраняют с помоцгью отжига мутантной ДНК с фрагментом комплементарной ДНК дикого типа. Было показано, что, отжигая химически синтезированный олигонуклеотид с фаговой ДНК, можно, напротив. [c.165]

Для клонирования пео-содержащих провирусов предложены две упрощенные методики каждая из них предполагает селекцию искомого клона в клетках . oli на устойчивость к канами-цину. Одна из методик представляет собой модифицированную процедуру спасения маркера и предусматривает прямое клонирование провируса в плазмидном векторе. Другая методика, гораздо более эффективная, требует применения специальных ретровирусных челночных векторов, описанных в разд. 9.3.2.4. [c.300]

Данные эксперименты по спасению маркера привели к разработке общей схемы введения чужеродных фрагментов ДНК в геном ортопоксвирусов. На первом этапе конструируют гибридную плазмиду, содержащую гетерологичный ген, фланкированный последовательностями вирусной ДНК из несущественной области вирусного генома. Полученную плазмиду вводят в клетки, инфицированные вирусом. За счет рекомбинации по областям гомологии между фланкирующими последовательностями в гибридной плазмиде и вирусной ДНК происходит встройка чужеродного фрагмента в геном вируса (рис. 14.31). Образовавшееся вирусное потомство более чем на 99 % состоит из вируса исходного типа, поэтому необходим метод селекции рекомбинантных вирусов. [c.392]

Фенотипический отбор рекомбинантов можно осуществлять также либо используя спасение маркера определенных мутантов VA , либо идентифицируя мутантные клоны, возникающие в результате инсерции в целевые вирусные гены чужеродных последовательностей. Так, X. Шида с соавторами в 1987 г. показали, что встройка экзогенных фрагментов в ген гемагглютинина VA может быть выявлена по отсутствию адсорбции куриных эритроцитов в бляшках вариантов НА . [c.393]

Некоторые космиды несут кроме прокариотических маркеров лекарственной устойчивости гены,, обеспечивающие селекцию эукариотических клеток. Наиболее удобные из них — это гены тимидинкиназы и устойчивости к антибиотику G418 [4] но в принципе можно использовать и некоторые другие. Наличие селектированного маркера, облегчающего введение ДНК в эукариотические клетки, может служить решающим критерием при выборе вектора. Описаны подходы, предполагающие спасение космидной ДНК в подобных экспериментах, что часто требует определенных комбинаций детерминант устойчивости [5]. [c.42]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология