Нуклеаза, фрагменты, комплементарное

П.З. ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКАЯ НУКЛЕАЗА И КОМПЛЕМЕНТАРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ [c.368]

Рис. 4-63. Многие виды рестрицирующих нуклеаз позволяют получать фрагменты ДНК с липкими (одноцепочечными) концами Фрагменты ДНК, обладающие такими концами, соединяются с помощью комплементарного взаимодействия пар оснований в области липких концов, как показано на схеме. Два фрагмента ДНК. объединяющиеся здесь, были получены с помощью рестрицирующей нуклеазы E o R1 (см. рис. 4-60).

S1 гидролизует одноцепочечную ДНК и оказывает слабое действие на двухцепочечную ДНК [17]. Следовательно, степень комплементарности между фрагментами меченой ДНК и избытком фрагментов немеченой ДНК можно определить, измерив количество ДНК, устойчивой к нуклеазе S1 (т. е. осаждаемой ТХУ), по радиоактивности. [c.144]

Исходный димер объединяемых генов состоит из генов 1 и 2, объединенных линкером, содержащим подходящие сайты рестрикции (/) димер фрагментируют ДНКазой I и образовавшиеся концы затупляют нуклеазой S1 (2) отбирают фрагменты, размер которых соответствует длине одного гена плюс длина линкера, (3) переводят их в кольцевую форму лигированием по тупым концам и 4) линеаризуют с помощью рестриктазы по сайту, который находится в линкере образующаяся в итоге библиотека генов содержит гибридные молекулы ДНК, кодирующие N-концевую часть белка 2 и С-концевую часть белка 1 (5) химерные гены клонируют в экспрессирующем векторе сразу или после амплификации с помощью ПЦР с использованием по одному из праймеров, комплементарных концам объединяемых генов, которые соседствуют с линкером, и после экспрессии химерных генов получают клонотеку химерных белков [c.330]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Матричный синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами, выполняет две основные функции репликацию ДНК, т.е. синтез новых дочерних цепей, комплементарных исходным материнским цепям, и репарацию двунитевых ДНК, имеющих бреши в одной из цепей, образовавшиеся в результате вырезания поврежденных участков этой цепи специальными нуклеазами. В обоих сл гчаях ДНК-полимеразы катализируют перенос дезоксирибонуклеотидных фрагментов от дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфатов на гидроксигруппу 3 -концевого фрагмента растущей или подлежащей регенерации цепи. Уравнение реакции с использованием сокращенной символики (см. 2.3) можно записать в виде [c.177]

Рис. 11.2. Диаграмма лииейной зависимости между аминокислотными последовательностями нуклеазы и ее фрагментами, которые дают продуктивную комплементарность. Рснтгеноструктурнымн исследованиями были показаны 5-струк-тура между остатками 12 и 35 и три (х-спиральных участка между остатками 55 и 67, 99 и 106, а также 122 и 133, которые отмечены на рисункс. Нуклеаза-(127-149) не связывается с нуклеазой-(1-126) [32].

Еще одним примером продуктивного комплементарного комплексообразования является комплекс двух других фрагментов той же нуклеазы, а именно комплекс, образованный нуклеазой-(1 — 126), приготовленной ограниченным триптическим гидролизом трифторацетилированной нуклеазы, и бромциановым фрагментом нуклеазы-(99—149). Этот комплекс обладает 10—12% ферментативной активности нативной нуклеазы [1154]. Оба упомянутые комплексы связывались с рс1Тр-сефарозой. [c.370]

Другой тип экспериментов по модификации позволяет непосредственно обнаружить расплетенную область ДНК, входящую в состав бинарного открытого комплекса. При разделении цепей ДНК неспаренные аденины становятся чувствительными к дополнительному метилированию в присутствии ДМС. Если затем фрагмент ДНК освободить от фермента, расплетенная область ренатури-рует, за исключением метилированных остатков аденина, которые теперь содержат метильные группы в положении N 1, принимающем обычно участие в комплементарном взаимодействии оснований. Метильные группы мешают основаниям А узнавать своих партнеров Т. Это несовершенство в спаривании можно обнаружить при помощи фермента нуклеазы 81, которая специфически расщепляет ДНК в любом одноцепочечном участке. Как обычно, результаты такого расщепления анализируют электрофоре-тически, определяя размеры образующегося фрагмента, меченного по концу. [c.147]

Многие рестрицирующие иуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки. Эти одноцепочечные концевые участки обладают способностью образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента, и потому их называют липкими концами (рис. 4-63). Липкие концы, образованные рестрикционными ферментами, позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК воедино при условии, что эти фрагменты образовались после действия одной и той же рестрицирующей нуклеазы (рестриктазы) (либо иной нуклеазы, которая создает такие же липкие концы). Таким образом, фрагмент ДНК любого происхождения можно встроить в очищенную ДНК автореплицирующегося генетического элемента, которым, как правило, является плазмида или бактериальный вирус. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду или вирус, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента ДНК. Исходный фрагмент может происходить прямо из геномной ДНК, или из к ДНК (комплементарной ДНК), т. е. из ДНК, полученной копированием матричной РНК. Эти методы детально обсуждаются в гл. 5. [c.231]

Рис. 4-71. Использование гибридизации нуклеиновых кислот для определения участка клонированного фрагмента ДНК, который транскрибируется в мРНК. Данный метод предполагает обработку нуклеазой, расщепляющей цепи ДНК, не спаренные с комплементарной цепью РНК Этот метод позволяет точно выявлять начало и конец молекулы РНК. Аналогичные процедуры эффективны и для определения расположения нитронов

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мыщей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. [c.240]

Рис. 5-78. Липкие концы, образующиеся под действием многих рестрицирующих нуклеаз (см. рис. 4-63), обеспечивают возможность соединения двух фрагментов ДНК за счет комплементарных взаимодействий. Фрагменты ДНК, соединивщиеся таким путем, связываются затем ковалентно в высокоэффективной реакции, катализируемой ДНК-лигазой. Здесь представлен случай образования рекомбинантной молекулы ДНК, состоящей из

Еще одно свойство рестрицирующих нуклеаз делает их удобным инструментом для клонирования генов. Многие из них вызывают ступенчатые разрывы, вследствие чего на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные хвосты . Их называют липкими концами, потому что они способны к комплементарном взаимодействию с любым другим конном, образовавшимся под действием того же фермента Благодаря липким концам, образуемым рестрицирующей нуклеазой, два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований (рис. 5-78). Можно, например, присоединить in vitro фрагмент ДНК, содержащий какой-нибудь ген человека, к хромосоме вируса бактерий и полученную таким путем новую рекомбинантную молекулу ДНК ввести затем в бактериальную клетку. Начав с одной этой рекомбинантной молекулы ДНК, инфицировавшей одн бактериальную клетку, репликационная машина вируса может менее чем за сутки выработать свыше 10 идентичных молекул вирусной ДНК. а значит, точно в такой же мере размножить и присоединенный к ней фрагмент ДНК человека. Вирус, используемый для подобной цели, называют клонирующим вектором. [c.327]

Так как рестриктазы расщепляют ДНК на ограниченное число фрагментов, они нашли применение для определения первичной структуры ДНК. Однако еще бо.ттее важная область их практического использования — генетическая инженерия, так как именно благодаря действию рестриктаз из ДНК выщепля-ются фрагменты, которые далее встраиваются в бактериальную ДНК, становятся интегральной частью бактериального генома и приносят бактерии новые, не свойственные ей ранее биохимические признаки, такие, например, как способность синтезировать интерферон, инсулин и другие белки, находящие широкое применение в медицине (рис. 81). В принципе, такие процессы возможны и в геноме высших организмов. Легкое встраивание рестрикционных фрагментов ДНК в реципиентную ДНК (т. е. ДНК, включающую эти фрагменты в свой состав) объясняется тем, что при действии рестриктаз в точке разрыва молекулы ДНК получаются липкие , комплементарные концы. Ввиду огромной теоретической ценности и большого практического значения этих работ в нашей стране начиная с 1975 г. осуществляются комплексные исследования по проекту Рестриктаза , который планируют на последующих этапах работы превратить в более широкий проект Нуклеаза и привлечь к его разработке различные научно-исследовательские институты. В 1980 г. большая группа советских ученых была удостоена 1осударственной премии за разработку регламентов получения 30 рестриктаз и внедрение их в практику работ по генетической инженерии. [c.226]

Кроме ДНК-полимераз, обладающих у прокариот к тому же нуклеазной активностью, в биосинтезе ДНК принимает участие ДНК-лигаза. Она открыта в 1967 г. одновременно в пяти лабораториях. Это белок с М = 96000. В клетке кишечной палочки, например, насчитывается около 2000 молекул ДНК-лига-зы. Ее функция состоит в обеспечении каталитического ускорения реакции образования фосфодиэфирной связи между 3 - и 5 -концами цепей ДНК, сближенных на расстояние одного нуклеотидного звена и закрепленных на комплементарной им, но непрерывной другой цепи ДНК. Такая ситуация возникает во многих случаях при устранении разрывов в одной из цепей ДНК, вызванных облучением, действием нуклеаз и т.п. при соединении новообразованного при репарации или в процессе нормальной репликации фрагмента с предшествующими или вновь созданными при этом фрагментами ДНК при ковалентном замыкании линейной молекулы ДНК в кольцевую структуру и т. п. Механизм ДНК-лигазной реакции представлен на рис. 84. ДНК-лигаза нашла применение в работах по синтезу генов и их фрагментов. [c.251]

Ранее был предложен имеющий много общего с описанными выше методами подход к получению делеционных субклонов в одноцепочечном векторе, основанный на построении с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I комплементарной цепи участков вставки, имеющих разную протяженность [Burton et al., 1988]. В цитируемой работе осуществлялся отжиг олигонуклеотидного праймера, в результате ферментативного удлинения которого происходило увеличение двуцепочечного участка вставки, причем производимый по времени отбор аликвот данной реакции обеспечивал получение их разной протяженности (рис. 8.14). Далее остающийся недостроенным одноцепочечный участок вставки и самого вектора удалялся нуклеазой S1. Затем с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, сайт которой находился в полилинкере поблизости от места клонирования вставки, вырезались делетированные варианты вставки. Их дальнейшее лигирование с заранее приготовленным вектором проводилось с таким расчетом, что происходила реориентация вставки, позволяющая секвенировать фрагменты ДНК со стороны делеций, давая, таким образом, возможность получить перекрывающиеся участки секвенируемой последовательности ДНК. [c.263]

Первичная структура. Если имеются данные о нуклеотидной последовательности одной цепи, то большинство профамм позволяют построить комплементарную цепь, вычислить нуклеотидный состав, выявить участки, богатые пуринами, пиримидинами или определенными сочетаниями оснований, и определить частоту встречаемости различных динуклеотидов (рис. 7.15). Могут быть выявлены специфические субпоследовательности в пределах определенного сегмента, что часто используется для нахождения сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз (рис. 7.16). В программу введена информация о сайтах узнавания для известных ферментов, и по одной команде выдаются сведения о положении этих сайтов для каждого из ферментов, числе ожидаемых фрагментов, образующихся при расщеплении ими ДНК, размере каждого фрагмента в парах оснований и его процентном отнощении к общей длине сегмента, а также о нуклеотидных остатках, соответствующих концам каждого фрагмента. Существуют также профаммы, которые могут предсказать, какие продукты будут получены при совместном действии двух или нескольких эвдо-нуклеаз. При этом предсказания делаются как для линейных, так и для кольцевых молекул. Полученная информация может использоваться для подтверждения данных секвенирования путем сравнительного анализа ожидаемого и реального результатов действия эндонуклеаз. [c.330]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология