Селекция клеток, методы

За последние годы в селекции продуцентов аминокислот активно начали использовать методы генной инженерии, позволяющие повышать дозу генов биосинтеза аминокислот путем их клонирования на плазмидах. Трансформируя гибридные плазмиды в клетки, удается повысить дозу генов и, следовательно, количество ферментов, ответственных за биосинтез соответствующей аминокислоты. [c.21]

Рис. 19.4. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых (Е8) клеток. Е8-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несушим трансген, культивируют и идентифицируют трансфицированные клетки методом позитивно-негативной селекции или ПЦР. Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку суррогатных матерей. Скрещивая животных-ос-нователей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных мышей.

После 1960 г. многие затруднения, встающие на пути биохимиков при использовании этого метода, были устранены в результате трех событий. Наиболее важную роль сыграл, возможно, тот факт, что промышленные компании взяли на себя поставку культуральных сред, сывороток, клеток и посуды для культивирования, что позволило выращивать клетки эпизодически или постоянно на самой различной поверхности — от менее одного квадратного сантиметра до нескольких квадратных метров. Это стало возможным только потому, что, с одной стороны, были созданы простые среды, обеспечивающие хороший рост клеток, а с другой — разработаны простые методы выделения первичных клеток, селекции клонов и хранения клеточных линий. [c.7]

Недавно разработанные методы, позволяющие получать целые растения из единичных клеток, а также осуществлять слияние растительных клеток, могут иметь революционизирующее значение для селекции растений. Они могут послужить также основой нового метода научения фенотипического выражения генов у растений. Так, например, из гаплоидных ядер пыльцевых зерен удалось вырастить целые гаплоидные растения . Поскольку клетки гаплоидных растений содержат, по-вндимому, только по одной копии -большого числа генов, то в таких растениях легко обнаружить мутации, вызванные облучением или химическими агентами, что в свою очередь может способствовать значительному ускорению селекционных работ. [c.268]

Погибает большое число нрототрофных клеток, мутанты же, которые не способны расти на минимальной среде, выживают. Затем клетки отмывают от яда и засевают на чашки Петри, со-держаш,ие агар и минимальную среду с некоторой добавкой универсальной среды. На этой среде оставшиеся неубитыми клетки дикого типа образуют большие колонии, а мутанты растут медленнее и дают мелкие колонии. В результате обогащения мутантов с помощью пенициллина удается обнаружить события, происходящие с очень малой вероятностью, например порядка 10 . Найдя на поверхности агара ауксотрофные мутанты, мы можем провести детальный анализ их недостаточности, пересевая их на пластинки с промежуточными средами, как говорилось выше. Метод Ледерберга и Зиндера — весьма важное развитие приемов селекции бактерий. [c.297]

Для наблюдения трансформации после первых классических работ, относящихся к передаче признака образования капсул пневмококками, были применены гораздо более удобные для количественного изучения генетические маркеры. Сюда относилась резистентность к разным ядам — стрептомицину, эритромицину, новобиоцину, сульфаниламидам далее — способность использовать различные источники углерода (мальтозу, лактозу, маннит) и т. д. Особенно проста постановка эксперимента по передаче резистентности к яду. Культура клеток, подвергшихся трансформации, попросту высевается на среду, содержащую яд. Все исходные клетки гибнут, а трансформированные растут и размножаются. Следовательно, селекция проводится на нулевом фоне, и метод весьма чувствителен. [c.344]

Генетические способы отбора требуют значительно меньших затрат труда, чем методы скрининга, что позволило разработать новые подходы, позволяющие проводить генетическую селекцию клонов, содержащих последовательности, гомологичные любой желаемой последовательности-зонду. Это дало возможность расширить применение этого метода, распространив его на задачи, обычно решаемые с помощью более трудоемких (и часто менее специфичных) методов скрининга. В общих чертах в основе всех этих подходов лежит следующее обстоятельство хотя в случае большинства специфических эукариотических последовательностей нельзя обеспечить генетическую селекцию в клетках Е. соИ, можно сконструировать пары векторов, позволяющие селектировать продукты гомологичной рекомбинации, обусловленной гомологией последовательностей между клонами. Такая селекция основана на том факте, что процессы, подобные репликации ДНК, транскрипции, мобилизации плазмид или упаковке ДНК в фаговые частицы, могут происходить только по is-схеме в отношении соответствующего регуляторного элемента (области начала репликации, промотора, сигнала мобилизации или упаковки). Чтобы исключить рекомбинацию между векторными последовательностями, нужно подбирать векторные пары, не обладающие взаимной гомологией (или в случае рекомбинации фагов без взаимной гомологии в пределах той области, которая определяется маркерами, используемыми для селекции). Соблюдение этого главного принципа лежит в основе и скрининга фаговых клонов с использованием рекомбинации между [c.77]

Например, можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, содержащей этот антибиотик. Нетрансформированные клетки без плазмид (и, следовательно, без гена устойчивости к антибиотику) просто не будут расти на такой среде. В последние годы разработано много специальных методов селекции, которые позволяют отби- [c.124]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

При работе этим методом используются экспоненциально растущие клетки, и важно на протяжении всей процедуры селекции поддерживать постоянное значение pH и температуры. [c.146]

Конструирование штаммов на основе ступенчатого отбора существенно упрощается и ускоряется, если использовать селективные и полуселективные методы, позволяющие отбирать нужные мутанты из большой популяции клеток. Многие из таких методов основаны на использовании структурных аналогов естественных метаболитов и субстратов. Например, в селекции продуцентов аминокислот широко применяют аналоги этих соединений. Действуя как ретроингибиторы или корепрессоры, аналоги выключают синтез естественных метаболитов, однако не могут заменить их функционально. Более того, нередко аналоги подавляют ферментативные реакции, в которых участвуют природные соединения. Поэтому на минимальной среде с аналогом выживают и образуют колонии лишь те клетки, у которых нарушены механизмы негативной регуляции биосинтеза соответствующей аминокислоты и которые вследствие этого избыточно ее синтезируют. (Устойчивость к аналогу могут вызывать также мутации, которые блокируют его поступление в клетку.) Часто проводят несколько этапов селекции, используя различные аналоги или повышающиеся концентрации одного и того же аналога, а также получая мутации ауксотрофности и мутации, вызы- [c.79]

Важнейшим методом селекции микроорганизмов является отбор мутантов, т. е. организмов с измененными наследственными признаками, которые появляются в результате мутаций. В самом широком смысле мутацию можно определить как внезапно возникающее наследуемое изменение в генетическом материале клетки. Следует различать мутации цитоплазматические, затрагивающие внехромосомные генетические детерминанты, и ядерные, или хромосомные. В свою очередь, хромосомные мутации можно разделить на три основных типа 1) изменение числа хромосом 2) изменение числа и порядка расположения генов (перестройки хромосом или структурные изменения) 3) изменения индивидуальных генов (внутригенные изменения, или мутации в наиболее узком смысле этого слова) (Ш. Ауэрбах, 1978). В селекции микроорганизмов основное значение имеют последние два типа мутаций. [c.70]

Гибридизация соматических клеток. Следующий метод клеточной селекции — создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соеди-нить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров. [c.154]

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соедршенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК -клетками. Клетки ТК легко отличаются от клеток TK , поскольку способны расти на средах с ами-ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных бьши использовапы гибриды бактериальных плазмвд с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. соИ и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК -клетки. Анализ мето- [c.125]

После получения различных сомаклональных вариаций от исходного растения наступает следующий этап — отбор необходимых сочетаний признаков. Данный вопрос решается с помощью клеточной селекции, которую проводят практически на любом объекте, введенном в культуру in vitro. Однако удобнее использовать суспензионную культуру или изолированные протопласты. Преимущество этих объектов состоит в быстром росте культуры и равномерном действии селективного фактора на все клетки. Для отбора сомаклональных вариаций соответствующие селективные факторы (соли в высоких концентрациях, гербициды и др.) добавляют в питательную среду для выращивания культуры клеток либо растущие культуры помещают в селективные условия (низкая или высокая температура, освещенность и т.д.). Существует несколько методов клеточной селекции [c.187]

Метод негативной селекции используется главным образом для выявления мутантов, ауксотрофных в отношении аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, витаминов и других важных метаболитов (Ю.Б.Долгих, З.П.Шамина, 1982). Ауксотрофные мутанты очень ценны для фундаментальных исследований механизмов генной регуляции синтеза этих веществ в клетке и в растении. [c.188]

До недавнего времени высокопродуктивные сорта сельскохозяйственных растений и новые породы животных получали методом селекции. Однако этот подход, требующий для своей реализации много времени, уступил место методам, основанным на генной инженерии высших организмов. Теперь гены, обусловливаюгцие специфические признаки, могут вводиться в клетки растений или животных и передаваться следующим поколениям (наследоваться). В ч. III мы рассмотрим, как получаются такие трансгенные растения и животные. [c.371]

При суперпродукции уровень экспрессии клонированного гена выражается в синтезе специфического белка в количестве не менее 2% от всех растворимых белков клетки-хозяина. В настоящее время имеются суперпродуценты, у которых количество синтезируемого специфического белка достигает 10—50% (здесь важнейшую роль играют многокопийные плазмиды, несущие встроенные гены). Генно-инженерными методами во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) был получен штамм E. oli, обладающий сверхпродукцией L-треонина (30 г/л за 40 часов ферментации). [c.446]

Кроме рассмотренной эписомной культуры, были отобраны еще энисомные культуры с локусом Pro, а также культура F с нрикреплепными к эппсоме маркерами Gal и X. Остановимся вкратце на том, каким образом проводится селекция этих необычайных бактериальных мутантов. Эксперимент ведется в два этапа. Сначала из культуры косвенно отбираются по методу отпечатков те Hfr, которые содержат интересующий нас локус (например. La ) вблизи конца хромосомы. Из генетической карты ясно, что нужно отбирать клетки Hfr, передающие с наибольшей вероятностью маркеры, помещающиеся рядом с La , например Т , TL и т. д. Можно выбрать такую культуру, чтобы маркер La в ней передавался женским клеткам через 2 часа после начала конъюгации и с малой вероятностью. Это означает, что он расположен в дальнем конце хромосомы. [c.328]

Ряд исследователей пришли к выводу, что у большинства амфидиплоидов генотипы двух родителей, объединенные в одной клетке, не могут функционировать как единое целое, и поэтому амфидиплоиды большей частью могут быть использованы только как исходный материал для селекции. Известны только единичные случаи, когда амфидиплоиды непосредственно используются для практических целей. Так, например, Киш путем гибридизации различных Triti ale и отбором выделил 42-хро-мосомный амфидиплоид, превосходящий по урожайности рожь и подходящий в качестве ее замены на песчаных почвах. Были также предприняты попытки применения методов отбора и искусственного мутагенеза для получения стабильных амфидиплоидов, что, однако, не дало пока существенного сдвига в разрешении этой проблемы. [c.143]

Книга написана людьми, судя по всему, слабо разбирающимися в биологии у некоторых (одноклеточных) организмов весь организм заключен в эту одну клетку (с. 3) и называется этот код универсальный код жизни (с. 4) генная инженерия — это наука из пробирки (с. 8) растения имеют стрекательные клетки (с. 3) нидерландские исследователи... обнаружили, что живые и целые гены устойчивости могут перепрыгивать из ГМ-продукта в кишечник человека и выживать там до нескольких минут (с. 20). Что такое живой ген и как он может прыгать Пытаясь объяснить простые биологические процессы, авторы строят фантастические конструкции. Например, они хотят доказать, что маки с красными листьями нельзя получить традиционными методами, а можно лишь генно-ин-женерными. (Это сомнительно. В листьях мака есть красные пигменты, и их количество можно увеличить путем селекции. В лепестки листья не превратятся, так как выполняют иные, несвойственные лепесткам, функции. Даже генная инженерия не избавит листья от необходимости осуществлять фотосинтез и содержать хлорофилл.) Существует барьер, предотвращающий покраснение листьев. Этот барьер может быть обусловлен двумя причинами красный ген во [c.150]

Путем микробиологического синтеза образуются L-аминокислоты, являющиеся продуктами жизнедеятельности специально подобранных и отселектированных штаммов микроорганизмов, которые способны накапливать в культуральной жидкости до 150 г/л синтезируемой аминокислоты. Чаще всего для микробиологического синтеза аминокислот используются ауксотрофные мутантные штаммы, которые получают методами обычной селекции или генной инженерии. С помощью мутагенных факторов у таких ауксотрофных штаммов индуцируется мутация, в результате которой прекращается или ингибируется синтез одного из продуктов, оказывающих регуляторное воздействие на ферментные системы, катализирующие образование данной аминокислоты, в результате чего концентрация этой аминокислоты в клетках мутанта и в культуральной жидкости повышается. [c.275]

Селекция по типу HAT и другие способы позволяют получать стабильные клеточные линии, несущие индивидуальные человеческие хромосомы. Существуют более прямые методы, позволяющие получать гибридные клеточные линии, содержащие определенные компоненты генома человека. Это гибридизация клеток мыши с микроклетками человека, несущими неполный геном, и эндоцитоз мышиными клетками изолированных хромосом человека. [c.304]

Одним из преимушеств метода НВЧ является возможность его использования в отсутствие способа культивирования бактерий на твердой среде. Второе преимущество заключается в том, что он удобен в случае высокой вариабельности кинетики роста. Предположим, что некоторые клетки из смешанной культуры растут быстро, образуя на агаре крупные колонии, которые, распространяясь по поверхности, маскируют появляющиеся позже мелкие колонии интересующего нас микроорганизма. Хотя количество таких мелких колоний может быть больше, их невозможно учесть на чашках из-за присутствия колоний более подвижных или быстрее растущих бактерий. Третье преимущество метода НВЧ состоит в том, что в присутствии не представляющих интереса организмов и в отсутствие подходящего метода селекции его можно использовать для выявления легко обнаруживаемых продуктов (например, пигментов или антибиотиков), продуцируемых изучаемыми микроорганизмами. В этом случае, несмотря на более выраженный рост контаминирующих микроорганизмов, количество исследуемых батерий определяют по числу пробирок, где образование характерных продуктов отсутствует. И наконец, метод НВЧ используют в случае, если агар или другие отвердители содержат некоторые факторы (например, тяжелые металлы), которые изменяют достоверность подсчета или взаимодействуют с изучаемыми бактериями. [c.467]

Принцип метода схематически показан на рис. 3.2. Космидные библиотеки, сконструированные в гесЛ -клетке, упаковывают в Я-частицы, чтобы получить лизат с высоким титром трансдуцирующих частиц. Аликвоты упакованной библиотеки используют затем для заражения гес+-клеток, в которые предварительно введена последовательность (или последовательности) -зонд, клонированная в плазмиде, не имеющей гомологии с космидным вектором. Через 30 мин — 2 ч, в течение которых должна произойти рекомбинация, космиды вновь упаковывают в фаговые частицы. Упакованные космиды используют для заражения гесЛ -хозяина, проводя селекцию по обоим маркерам лекарственной устойчивости — плазмидному и космидному. Поскольку плазмида не несет os-последовательностей, она будет перенесена в реципиентные клетки только в случае рекомбинации с гомологичной последовательностью в космидном клоне. Для того чтобы восстановить исходную космиду, можно вновь разделить два клопа в результате второго рекомбинационного события и после переноса в нового хозяина идентифицировать ревертантов на индикаторных чашках. Как будет сказано ниже, точное восстановление, однако, не всегда возможно (или желательно). [c.78]

Ген металлотионеина представляет собой еще один амплифицируемый маркер, работа с которым подробно освещена в данной главе. Особенно хорошо изучен один из двух генов мыши m-mtl, этот ген невелик, и его геномную копию удобно клонировать в плазмидных векторах [8]. Попытки использовать данный ген в качестве доминантного селективного маркера окончились неудачей (кроме векторов на основе ВРУ [19]). Поэтому для первичной селекции требуется дополнительный маркерньп ген. Эти недостатки компенсируются в ряде случаев простым и недорогим методом селекции клеток на амплификацию мышиного гена rn-mtl, хотя число копий на клетку в этой системе не превышает 100. [c.244]

Более сложный технически, но часто дающий более удовлетворительные результаты метод получения чистых вирусных препаратов (т. е. не содержащих хелперных вирусов) предусматривает последовательное использование двух разных упаковывающих линий так, что вирус, продуцируемый первой клеточной линией (после трансфекции соответствующей ДНК) инфицирует затем вторую линию клеток [36] (рис. 9.5). Необходимое условие при этом наличие в векторе подходящего маркера для осуществления селекции инфицированных клеток. Чтобы обмануть свойственный упаковывающим клеткам иммунитет к инфицированию вируса той же тропности, вирус пересаживают из амфотропной упаковывающей линии на эко-тропную или наоборот. Если такое решение вопроса неприемлемо, скажем по соображениям возможной биологической опас- [c.289]

Чаще всего этот метод отбора применяют в селекции п[)оду-центов антибиотиков. Различные антибиотики имеют разн1лй механизм действия на микробную клетку некоторые являются ингибиторами белкового синтеза, другие мембрапотронпымп [c.92]

В обоих случаях для улучшения штаммов классическая селекция применяла мутагенез с последующим отбором. В тех случаях, когда это было возможно, применялись методы скрещивания или другие способы передачи генетической информации. В последние годы эффективным методом передачи генетической информации признано слияние протопластов. Тем не менее применение этих методов ограничено, так как мутации способны лишь изменить (скорее нарушить) систему регуляции микроорганизма. Генетический обмен помогает собрать в одной клетке полезные мутации и избавиться от вредных. Все до сих пор суп1,ест-вовавшие методы генетического обмена ограничены пределами одного вида (или близкородственными видами), так как основаны на классической рекомбинации. На молекулярном уровне это означает высокую гомологию в последовательностях ДНК- С помощью методов генной инженерии создалась возможность для введения новой генетической информации в клетку или увеличения копийности уже существующих генов. [c.106]

Вопрос о стабилизации полученного штамма был решен следующим способом в хромосоме штамма-продуцента локализована мутация, которую мы рассматривали выше, — это лики-мутация (частичный блок) по треониндезаминазе — первому ферменту на пути от треонина к изолейцину. Среди многих мутаций такого типа была выбрана одна, способная обеспечивать бактерию необходимым для роста количеством изолейцина при условии, что клетка производит треонин в очень больших количествах. Если по каким-либо причинам клетка перестает производить избыток треонина (потеря плазмиды, структурная перестройка плазмиды), то она уже не может обеспечить биосинтез нужного количества изолейцина и погибает. Как уже упоминалось, потеря плазмиды происходит с частотой около 10" па одну генерацию. Гибель клеток в таком количестве не препятствует нормальному росту популяции. С другой стороны, клетки Е. соИ, потерявшие плазмиду, обычно обгоняют в скорости роста плаз-мидные варианты и довольно быстро вытесняют последние из популяции. Поэтому необходимо тем или иным методом устранять возникшие бесплазмидные клетки. Дальнейшая селекция, оптимизация условий ферментации привели к созданию рекордно [c.110]

Одноступенчатый способ синтеза аминокислот с помощью микроорганизмов получил наибольшее распространение, особенно в СССР. Он основан на культивировании строго определенного штамма — продуцента целевой аминокислоты на среде заданного состава при соответствующих параметрах процесса ферментации. Используемый штамм обладает способностью к сверхсинтезу необходимой аминокислоты. Для этой цели, как правило, выбирают полиауксотрофные мутанты, т. е. те клетки микроорганизма, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для роста и развития различные аминокислоты, а с другой — приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты. Такие мутанты возможно получить либо путем воздействия различных мутагенов физической и химической природы на исходную культуру микроорганизма с последующей селекцией штамма, по заранее заданным признакам, либо методом генной инженерии. [c.16]

Универсальность, относительная простота и доступность метода слияния протопластов делают особенно полезным его применение в селекции промышленных микроорганизмов. Как уже отмечалось, генетическая рекомбинация в сочетании с мутагенезом создает огромное многообразие форм и резко увеличивает материал для отбора. Тем самым значительно повышается производительность работы по получению новых штаммов с улучшенными свойствами. Метод слияния протопластов позволяет объединять в одном геноме мутации, положительно влияющие на продуктивность и полученные в разных селекционных линиях, в том числе такие, которые трудно или даже невозможно последовательно индуцировать в одной и той же клетке, а также избавляться от вредных мутаций, снижающих жизнеспособность штаммов-про-дуцентов. Во многих отношениях этот метод является более эф- [c.131]

Многие успехи современной молекулярной биологии и селекции микроорганизмов основаны на применении индуцированного мутагенеза in vivo (см. гл. 2). Типичная схема опыта по получению мутантов бактерий и фагов заключается в обработке клеток мутагеном и скрининге среди потомков клеток с измененным фенотипом. Далее следует огромная работа, связанная с картированием мутаций, доказательством отсутствия других мутаций, влияющих на фенотип. Хотя метод этот чрезвычайно трудоемок, он обладает тем преимуществом, что не нуждается в предварительных гипотезах и знаниях относительно роли того или иного белка в проявлении данного фенотипа. Метод мутагенеза и ступенчатого отбора позволяет вести селекцию продуктивных штаммов микроорганизмов, недостаточно генетически изученных, и получать продуценты метаболитов, для которых не установлен путь биосинтеза. Велико значение индуцированного мутагенеза как поставщика новой информации для исследователей, занимающихся молекулярной биологией и биохимией. Расшифровка на молекулярном уровне новых мутантных фенотипов открывает возможности выяснения путей биосинтеза и ре-гуляции метаболизма нормальной клетки. [c.159]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология