Фланкирующие последовательности

Рис. 17.3. Генетическая карта Ti-плазмиды (масштаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина, которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках. За пределами Т-ДНК находится кластер г/г-генов, ген(ы), кодирующий(е) фер-мент(ы) катаболизма опина, и сайт инициации репликации ori), которьш обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в А. tumefa iens. Л и П - левая и правая фланкирующие последовательности соответственно.

Рис. 5.18. Первый раунд ПЦР. ДНК-мишень фланкирована последовательностями Г—2 в одной цепи и последовательностями 1—2 — в другой. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу и четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP). Смесь нагревают до 95 С, инкубируют в течение 1 мин и медленно охлаждают до 55 °С. При этой температуре праймеры, добавленные в избытке, спариваются с разделенными цепями. Повышают температуру до 75 °С. В этих условиях происходит синтез обеих цепей ДНК, начинаюший-ся с 3 -гидроксильных концов праймеров. Каждая из синтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3 -гидроксильной группы ее праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Эти цепи служат матрицами во втором раунде ПЦР.

Несцепленные гены в клетке могут подвергаться согласованной регуляции для обеспечения эффективного ответа на такие внешние факторы, как присутствие в среде гормонов, рост ткани за счет клеточной пролиферации, стрессовые факторы, типа голодания или теплового шока. Ключ к пониманию механизмов, обеспечивающих согласованную регуляцию, может быть найден при сравнении 5 -фланкирующих последовательностей согласованно регулируемых транскрипционных единиц. Примеры, приведенные в табл. 16.3, указывают на то, что для генов, подверженных согласованной регуляции, характерно наличие сходных коротких последовательностей, расположенных на различном расстоянии от точки инициации транскрипции. В ряде случаев с помощью анализа мутантов показано, что такие общие последовательности действительно необходимы для индукции. Так, в дрожжевом гене his 4 в 5 -концевой области содержатся три очень сходных по структуре повтора, которые присутствуют также в других генах биосинтеза аминокислот. Для предотвращения индукции гена в ответ на аминокислотное голодание необходима делеция всех трех повторов, которая в то же время не сказывается на обычном конститутивном уровне экспрессии гена his 4. [c.224]

Рис. 25.11. В популяциях человека широко представлены 9 гаплотипов семейства Р-глобинов. Можно выделить два больших сегмента в последовательности 5 -участок включает гены г, 7, и фР З -участок состоит из гена Р и фланкирующей последовательности длиной 18 т.п.н. Три распространенных типа последовательности 5 -участка обозначены

Рис. 17.9. Схематическое представление Т-ДНК, входящей в состав вектора. После интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения транспозаза может вырезать селективный маркерный ген и встроить его в другой хромосомный сайт. Обозначения Л и П — левая и правая фланкирующие последовательности, Ве — мобильный элемент. Промоторы и сигналы терминации транскрипции гена транспозазы, гена, интересующего исследователя, и селективного маркерного гена не показаны.

Переход Т-ДНК в одноцепочечную форму начинается с внесения в нее разрывов по обеим фланкирующим ее последовательностям. При этом правая фланкирующая последовательность оказывается на 5 "-конце одноцепочечной Т-ДНК, а левая - на 3 -конце. Предполагается, что интеграция Т-ДНК в геном растения зависит от специфических последовательностей, локализованных в правой фланкирующей последовательности, которая содержит повтор длиной 25 п. н. Аналогичный повтор присутствует и в левой последовательности, однако, как показывает делеционный мутагенез, она не принимает участия в интеграции. [c.376]

Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности. [c.377]

Эти примеры, так же как и те, что были рассмотрены ранее, указывают на то, что 5 -фланкирующие последовательности в ряде транскрипционных единиц, вероятно, взаимодействуют с позитивными регуляторными элементами (по всей видимости, белковой природы). Если бы на эти последовательности действовали также отрицательные регуляторные элементы (репрессоры), то можно было бы ожидать, что по крайней мере некоторые мутации, вызывающие делеции или иные изменения в этих последовательностях, приводили бы к конститутивной транскрипции, что противоречит имеющимся фактам. Это, однако, не означает, что в эукариотических клетках вовсе не существует репрессоров. Данные, указывающие на участие репрессоров в регуляции экспрессии у эукариот, будут представлены в этой главе и гл. 17. [c.226]

I может осуществиться при наличии множества копий ге- нов со сходными экзонами, даже в том случае, если их фланкирующие последовательности и интроны различаются (гл. 21). Это происходит вследствие неправильно-I го спаривания соответствующих экзонов неаллельных генов. Можно представить себе, насколько чаще наблюдается неточное расположение цепей ДНК друг против друга в тандемных кластерах идентичных или почти идентичных повторяющихся последовательностей. За исключением концов кластера, наличие взаимосвязи между следующими друг за другом повторами может даже сделать невозможным выявление точно соответствующих повторов. [c.307]

Эндонуклеазы расщепляют определенные связи внутри молекул РНК, что приводит к образованию дискретных фрагментов. Эти ферменты участвуют в реакциях разрезания, в которых нуклеотидные последовательности зрелой РНК отделяются от фланкирующих последовательностей. [c.310]

По аналогии с прокариотами можно ожидать, что в инициации транскрипции эукариотических генов должны участвовать промоторные последовательности, расположенные в ДНК недалеко от точки инициации синтеза РНК (с 5 -конца данного гена). С использованием методов, описанных в гл. 9, удалось клонировать значительное количество структурных генов из различных эукариотических клеток и их вирусов. Сравнение 5 -фланкирующих последовательностей этих генов позволило выявить очень характерную А-Т-богатую последовательность, распо- [c.208]

Интересный пример неравновесности по сцеплению был обнаружен в работе Кана и соавторов по кластеру (группе) генов Р-глобина в популяциях человека (рис. 25.11). Несколько сотен клонов, полученных от разных людей, анализировали с помощью рестрикционных эндонуклеаз. Длина каждого клона оказалась равной приблизительно 50 т.п.н в состав каждого из них входило по пять функциональных генов и одному псевдогену. Обнаружены и межгенные (фланкирующие) участки. Выявлено 12 полиморфных сайтов семь во фланкирующих последовательностях, три в интронах, один в псевдогене ( /Э1) и один-в кодирующем участке (мутация талассемии). Девять сайтов полиморфны во всех человеческих популяциях, причем каждый вариант представлен с частотой не ниже 5% остальные три сайта полиморфны лишь в популяциях негров. Относительно шести полиморфных сайтов известно, что различия затрагивают одну пару нуклеотидов вероятно, также обстоит дело и в отношении остальных шести полиморфных сайтов. [c.182]

Транскрипция во многом сходна с репликацией. Матрицей при синтезе РНК служит определенный участок одной из цепей ДНК. РНК-полимераза копирует этот участок, последовательно соединяя друг с другом с помощью 3 —5 -фосфо-диэфирных связей рибонуклеотиды в соответствии с правилом комплементарности (рис. 3.9). В ходе транскрипции новосинтезированная молекула РНК отсоединяется от ДНК, и двойная спираль ДНК восстанавливается. Чтобы обеспечить транскрипцию только отдельных сегментов ДНК, должны существовать некие сигнальные последовательности, указывающие, где начинается (инициируется) транскрипция и где она останавливается (терминируется). Сигнал инициации обычно располагается перед кодирующей последовательностью, а сигнал терминации — вслед за ней. Участок ДНК, предшествующий транскрибируемому гену, называется 5 -фланкирующей последовательностью, а расположенный за ним — З -фланкиру-ющей. [c.35]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация - иногда в миллионы раз - осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы 1) два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень их 3 -гидроксильные концы после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу 2) ДНК-мишень длиной от 100 до -35 ООО п. п. 3) термостабильная ДНК-по-лимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95° и выше 4) четыре дезокси-рибонуклеотида. [c.94]

Транспозон Тп5 встроили в плазмиду и генетически модифицировали его левую и правую фланкирующие последовательности и удалили ген транспозазы. Такой модифицированный транспозон не может вырезаться из плазмиды даже с помощью экзогенной транспозазы. [c.340]

Для выделения растительных промоторов из некоторых видов растений использовали специализированные так называемые промотор-направленные векторы и систему трансформации на основе Ti-плазмид Agroba terium. Суть подхода состоит в следующем. Репортерный ген без промотора встраивают сразу за правой фланкирующей последовательностью вектора на основе Ti-плазмиды, и после переноса Т-ДНК в хромосому растения он оказывается в окружении растительной ДНК. Если Т-ДНК встроится в промоторный участок функционального гена, то произойдет транскрипция репортерного гена. Для идентификации растительных промоторов в качестве репортерного гена можно использовать ген [c.383]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

Прогулка по хромосоме ( hromosome walking) Метод идентификации нуклеотидных последовательностей, фланкирующих известные гены, для которых имеются олигонуклеотидные зонды. Фланкирующие последовательности используются затем в качестве зондов для идентификации прилегающих к ним последовательностей, и т,д. [c.557]

Мы можем определить рамки действия описанных механизмов, сравнивая нуклеотидные последовательности дуплицировавшихся генов. Если эти последовательности подвергались сопряженной эволюции, мы не увидим накопления замен в молчащих сайтах (поскольку процесс гомогенизации касается их в той же степени, как и сайтов замещения). Известно, что механизм, обеспечивающий гомогенизацию последовательностей, не обязательно распространяется за пределы гена, поскольку в некоторых случаях дуплицировавшиеся гены имеют совершенно разные фланкирующие последовательности. Действительно, можно увидеть, что границы концов гомогенизированных последовательностей резко выделяются. Кроме того, необходимо помнить, что наличие таких механизмов может обесценить определение хода эволюции таких генов на основании их дивергенции, поскольку дивергенция свидетельствует только о времени, прошедшем с момента последнего события гомогенизации/регенерации, а не исходной дупликации генов. [c.278]

Удобный объект для изучения сплайсинга-температурочувствительные мутанты дрожжей, у которых не удаляются интроны, и в ядре накапливаются предшественники тРНК, имеющие прерывистое строение. Процессинг фланкирующих последовательностей может происходить обычным способом. Молекулярный механизм возникновения этого дефекта неясен, но известно, что он специфичен для прерывистых генов, поскольку тРНК, кодируемые непрерывными генами, могут созревать и транспортироваться в цитоплазму. [c.318]

Распространяется ли фазирование нуклеосом от центромерной последовательности, или же это свойство самих фазированных последовательностей В плазмиде, содержащей эти последовательности, но не имеющей центромерной области, фазирование сохраняется. Из этого следует, что естественная центромерная область характеризуется двумя особенностями. Консервативная последовательность образует некую безпуклеосомную структуру. А фланкирующим последовательностям присуща способность фазировать свои нуклеосомы. [c.392]

Способность включать фланкирующие последовательности хозяина аналогична свойству некоторых бактериальных транспозонов, хотя способность к включению может быть иногда обусловлена скорее наличием усилителя (enhan er), чем промоторными последовательностями. Активность провирусного генома, вероятно, зависит и от сайта, в котором произошла интеграция вируса в геном хозяина. [c.492]

Для идентификации в 5 -фланкирующей последовательности нуклеотидов, вовлеченных в регуляцию транскрипции гена tk, можно было бы вводить мутации в каждое положение. Такой подход оказался бы чрезвычайно трудоемким. Более эффективный метод, названный лин-керным сканированием, был использован в работе Мак-Найта и его коллег. Этот метод (рис. 16.2) включает создание в клонированном гене tk двух наборов делеций-с левого и с правого конца клонированной последовательности. Протяженность делеции в каждом делеционном варианте фиксировали с помощью определения нуклеотидной последовательности. Были получены 43 различные делеции с 5 -конца и 42-с З -конца, вошедшие в состав мутагенизированных таким образом генов tk (рис. 16.2). С использованием подходящих делеционных мутантов из каждого набора можно было сконструировать гены, содержаище мутации замещения и отличающиеся от нормальной последовательности tk в десяти или менее положениях нуклеотидных пар. Некоторые из этих мутантных последовательностей показаны на рис. 16.3. [c.212]

Взаимосвязь 5 -фланкирующих последовательностей, необходимых для индукции, и гиперчувствительных участков еще окончательно не установлена. Последовательность, необходимая для транскрипции гена hsp 70 в ответ на тепловой шок, расположена внутри гиперчувствитель-ного участка перед геном. В то же время гены теплового шока Drosophila содержат гиперчувствительные участки и в отсутствие теплового шока. Таким образом, в этом случае образование открытой структуры хроматина может быть необходимым условием, но в то же время оно, вероятно, не является фактором, непосредственно активирующим транскрипцию. [c.226]

Большинство привнесенных генов в клетках трансгенных животных для правильной экспрессии требуют гораздо больше фланкирующей последовательности, чем ген Sgs-3. Более того,) разных трансгенных особей наблюдаются разные уровни активности этих генов. Так как подобные вариации зависят от того, где трансген встроился в хромосому животного-хозяина, их называют эффектом положения в хромосоме. Некоторые результаты, полученные при встраивании гена альфа-фетопротеина мыши в случайные области ее генома, представлены в табл. 10-2. В данном примере ген активен только в тех гканях. гле он экспрессируется и в норме, однако уровень его транскрипции обычно в пять-десять раз ниже, чем он должен быть в тех тканях, где его активность высока. И наоборот, уровень транскрипции может быть аномально высок в тканях, где обычно уровень экспрессии этого гена низок. [c.211]

Смотреть страницы где упоминается термин Фланкирующие последовательности: [c.217] [c.379] [c.390] [c.391] [c.393] [c.398] [c.399] [c.409] [c.411] [c.469] [c.151] [c.246] [c.270] [c.298] [c.332] [c.358] [c.408] [c.209] [c.216] [c.217] [c.217] [c.220] [c.101] [c.184]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология