Методы воссоединения фрагментов ДНК

Методы воссоединения фрагментов ДНК [c.141]

Разработаны специальные методы воссоединения фрагментов [c.141]

Методы гибридизации ДНК состоят в смешивании одноцепочечных фрагментов ДНК, полученных от двух разных видов. Доля в смеси общей ДНК, которая воссоединяется, образуя двух цеп очечные спирали, и скорость воссоединения служат ме-рам-и степени генетического родства между данными видами. [c.361]

Методы гибридизации ДНК состоят в смешивании одноцепочечных фрагментов ДНК двух разных видов. Доля общего количества ДНК в смеси, которая воссоединяется с образованием двухцепочечных спиралей, и скорость воссоединения служат мерами степени генетического родства между этими видами. [c.286]

Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro, т. е. в пробирке , с последующим введением новых ( рекомбинантных ) генетических структур в живую клетку. Так как с химической точки зрения ДНК всех организмов однотипна, то in vitro возможно воссоединение фрагментов ДНК из любых организмов. В этом смысле рекомбинация in vitro отличается от обычной генетической рекомбинации, которая требует гомологии ДНК и, как правило, осуществляется в пределах одного или близкородственных видов. Другими словами, обычные методы обмена генетической информацией позволяют провести обмен генами внутри одного вида, тогда как генетическая инженерия, в принципе, открывает возможность, для перемещения генов в пределах всех живых организмов. Техника генетической инженерии впервые позволила получать индивидуальные фрагменты ДНК в достаточных количествах из геномов любой степени сложности, в сочетании с методами быстрого определения последовательности оснований в ДНК эта техника впервые открыла исследователям путь к выяснению строения генов высших организмов, в том числе и человека. [c.134]

Наиболее простой и широко применяемый метод соединения фрагментов ДНК — это отжиг фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазой, образующей липкие комплементарные однонитевые, концы, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, т. е. восстанавливает ковалентную непрерывность цепей ДНК (см. рис. 19). Наличие липких концов не является обязательным условием для воссоединения фрагментов ДНК-лигазой. Так, ДНК-лигаза, кодируемая фагом Т4 (но не лигаза Е. oli), способна соединять и полностью двунитевые фрагменты. Однако, для того чтобы эта реакция протекала эффективно, необходимо наличие высокой концентрации ДНК и значительно большей (приблизительно в 10 раз) концентрации фермента. [c.141]

Основными достоинствами коннекторного метода являются возможность его применения независимо от природы и способа получения фрагментов ДНК и высокий выход рекомбинантных молекул. Важно, что при таком способе воссоединения фрагментов ДНК не могут образоваться исходные кольцевые векторные молекулы. [c.142]

Образование делеций. Ранее уже отмечалось, что делеции и вставки размером в несколько десятков нуклеотидных пар можно получить методами с использованием олигонуклеотидов. Делеции и вставки размером в несколько нуклеотидных пар можно получить, удаляя выступающие концы рестриктов нуклеазой S1 или заполняя их ДНК-полимеразой. В результате после воссоединения рестриктов ДНК-лигазой фага Т4 в молекулах ДНК появляются микроделеции или микровставки. При желании увеличить размеры делеций концы рестриктов дополнительно обрабатывают подходящими экзонуклеазами. К большим делениям приводит удаление из фрагмента ДНК л тка, находящегося между двумя сайтами рестрикции, последов т " ным действием рестриктазы и лигазы. [c.264]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология