Рестриктазы действие

При построении рестрикционных карт обычно используют несколько рестриктаз, поэтому приходится анализировать сложные соотношения между фрагментами, полученными под действием различных ферментов. Процедуру картирования можно значительно упростить с помощью специальных приемов. [c.45]

В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]

Рис. 9.6. Электрофоретический анализ ре- -стрикционных фрагментов ДНК. ДНК фага X инкубировали с различными указанными на рисунке рестриктазами время, достаточное Для того, чтобы во всех чувствительных сайтах произошло расщепление нуклеотидной последовательности. Образовавшуюся смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. Полосы идентифицировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием. Стартовые точки обозначены жирными стрелками. Интактная ДНК фага X представляет собой линейную молекулу длиной около 48 500 н. п. При действии рестриктазы ВдШ возникают фрагменты длиной 22800,

Секвенирование фрагмента 4, получаемого совместным действием рестриктаз Нае 111 и Нра I, позволяет однозначно расположить друг относительно друга фрагменты I и 2 [c.16]

Комбинируя методы концевой метки и неполного расщепления, можно определить расположение всех фрагментов, полученных под действием одной рестриктазы. Сочетая этот метод с методом перекрывающихся фрагментов, а также используя несколько рестриктаз, можно быть уверенным, что построенная рестрикционная карта включает всю ДНК и ни один из мелких фрагментов не потерян. [c.46]

Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. соИ НЕ 101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом X. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа X, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [c.248]

Рестриктазы — ферменты ДНК-азного типа действия, катализируют деполимеризацию ДНК в строго определенных участках молекулы. Рестриктазы обладают высокой специфичностью действия относительно азотистых оснований, расположенных рядом с расщепляемой связью. Они используются для расшифровки последовательности нуклеотидных остатков в ДНК фагов и вирусов, а также находят широкое применение в генетической инженерии для получения рекомбинантных ДНК (гл. 31). [c.424]

Дезоксирибонуклеазы (К-Ф.3.1.4.5) — собирательное название многих с различной степенью специфичности гидролизующих ДНК ферментов. Их можно разделить на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы. Эндонуклеазы весьма условно также делятся на две группы — ДНК-аза I и ДНК-аза П. Действие ферментов первой группы приводит к образованию из ДНК дезоксинуклеозид-5 -фосфатов. Действие второй группы заканчивается образованием дезоксинуклеозид-З -фосфатов. Со временем все очевиднее становится условность такого разделения, поскольку между этими двумя крайними случаями обнаруживается большая часть других ферментов этого класса. В настоящее время описано много ДНК-специфических эндонуклеаз различного биологического происхождения. Большой теоретический и практический интерес среди них представляют так называемые рестриктазы — эндонуклеазы, которые весьма специфически, в зависимости от нуклеотидной последовательности расщепляют ДНК- Такими являются, например, бактериальные эндонуклеазы, способные расщеплять вирусную ДНК, отличающуюся от ДНК хозяина характером структурной модификации. [c.48]

Рестриктазы представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. Таким образом, при действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которого был выделен фермент, и [c.25]

Рис. 1.1. Разделение фрагментов ДНК, полученных в результате действия рестриктаз с помощью электрофореза в агарозном геле

Соединение фрагментов по тупым концам. Тупые концы фрагментов ДНК, полученные после действия рестриктаз, производящих прямой разрез внутри сайта рестрикции, также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность на порядок ниже, чем при сшивке по липким концам. Однако преимущество соединения фрагментов с тупыми концами по сравнению с липкими 6 том, что не имеет значения, какие рестриктазы образовывали эти тупые концы фрагменты, образованные в результате действия разноименных рестриктаз, легко соединимы (рис. 1.5). [c.34]

Четыре фрагмента, полученные в результате действия рестриктазы А (см. рис. 3.1), элюировали из геля и обработали рестриктазой В (четыре геля слева). Также три полоски, полученные после обработки рестриктазой В, выделили и обработали рестриктазой А (три геля в центре). В контрольной пробе интактную ДНК обрабатывали двумя рестриктазами одновременно (гель справа). [c.45]

Все данные, полученные при сравнении специфического действия рестриктаз А и В, сведены в рестрикционную карту на рис. 3.3. Таким образом, молекула ДНК размером в 5000 п. н. поделена на серии участков определенной длины, расположенные между участками, специфически узнаваемыми двумя рестриктирующими ферментами. [c.45]

Эффективным способом освобождения от исходных немутантных молекул ДНК может быть использование рестриктаз, действие которых зависит от метилирования сайтов рестрикции [21, 22]. При таком подходе работу по введению мутаций с помощью олигонуклеотидов начинают на плазмидной ДНК, сайты рестрикции на которой для этих рестриктаз, в частности Dpn, полностью метилированы Оат-метилтрансферазой in vitro. После [c.292]

При метилировании бактериальной ДНК в соответствующих сайтах она становится иммунной к рестрикта-зам (рис. 34.1). Такая защита необходима для предотвращения деградации ДНК клетки под действием ее собственных рестриктаз. Однако этот способ защиты не распространяется на любую чужеродную ДНК, входящую в клетку. Она имеет немодифицированные сайты-мишени и поэтому атакуется ферментом рестрикции. Следовательно, комбинация модификации и рестрикции позволяет клетке отличать чужеродную ДНК от своей собственной. [c.432]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Сопоставление карты рестрикции с генетической картой можно осуществить, действуя рестриктазами на ДНК, выделенную из различных мутантов фага X с известными делециями и перестройками в геноме. Сравнивая фрагменты ДНК фагов дикого типа и мутантных, можно определять участки генетической карты фага X, в которой локализованы соответствующие фрагменты. [c.272]

Отсутствие молекулярно-генетических препятствий для экспрессии клонированных генов, как уже отмечалось, не гарантирует успеха в таких экспериментах. Необходимым условием является реализация определенных механизмов, обеспечивающих опережающее по сравнению с рестриктазой действие метилазы на ДНК реципиентного штамма. Самым простым способом достижения этой цели могла бы быть опережающая экспрессия метилазного гена. Это может реализовываться или путем его опережающей транскрипции и (или) трансляции или какими то другими механизмами. В литературе отсутствуют генетические данные о существовании регуляторных генов контролирующих экспрессию генов гт II типа. Для генов гт предполагается конститутивная экспрессия. Однако, конститутивная их экспрессия не исключает возможности наличия механизмов контролирующих ее уровень. [c.107]

Рис. 5. Расщепление рестриктазами крупного сегмента гена Р-цепи глобина кролика с образованием перекрывающихся фрагментов Секвенированне фрагмента 4, получаемого совместным действием рестриктаз Нае III К Нра 1. позволяет однозначно расположить друг относктельно Друга фрагменты I Н 2

Системы рестрикции II типа обнаружены у очень многих бактерий. Эти системы состоят из двух отдельных ферментов, рестриктазы н метилазы, узнающих одну и ту же последовательность ДНК — сайт рестрикции. Если сайт рестрикции не метилирован, то рестриктаза вносит в него двуцепочечный разрыв. ДНК не подвергается рестрикции, если хотя бы одна цепь метилирована. Такие свойства предохраняют собственную ДНК бактерий от рестрикции собственная ДНК либо полностью метилирована по всем сайтам рестрикции, либо, после репликации, патуметилирована. На полуметилированные сайты рестрикции действует метилаза и метилирует их полностью. Как и прочие клеточные метилазы, метилазы системы рестрикции-модификации в качестве донора метильных групп нс-патьзуют 5-аденозилметионин. В табл. 7 для примера приведены данные о некоторых рестриктазах и метилазах II типа. [c.130]

Принцип метода иллюстрирует рис. 148. Фрагмент ДНК, по которому ведется отбор, например содержащий определенный ген, встраивают и размножают в плазмиде. Очищенные плазмиды дробят ультразвуком или линеаризируют действием рестриктаз, а затем меркурируют, как описано выше. Фрагментированные ДНК или РНК, из которых надлежит отобрать комплементарные участки, гибридизуют с ДНК меркурированных плазмид в условиях, когда последняя находится в избытке. Гибридные молекулы (вместе с молекулами ренатурпрованной плазмидной ДНК) вносят на колонку SH-сефарозы. При этом нити плазмидной ДНК через атомы ртути ковалентно связываются с сорбентом (на рис. 148 для ясности он изображен в виде ааштрихованных полосок у стенок колонки, тогда как в действительности он заполняет весь ее объем). Промывка колонки удаляет из нее не вошедшие в состав гибридов, т. е. пе комплементарные к плазмидной ДНК фрагменты нуклеиновых кислот. Затем следует элюция 97 %-ным формамидом нри повышенной темнературе. Двунитевые структуры диссоциируют, и очищенные комплементарные участки ДНК или РНК, не будучи связанными с матрицей, выходят из колонки. Остающуюся в колонке меркурированную плазмидную ДНК можно снять, как обычно, элюцией -меркаито-этанолом. [c.438]

Р. осуществляются только в отношении двухдепочечных молекул ДНК. Одноцепочечщ.1е ДНК нек-рых фагов модифицируются или подвергаются рестрикции только тогда, когда они находятся в фазе репликации. В то же время для обеспечения устойчивости к рестриктазам достаточно модификации только одной из цепей ДНК. По этой причине ДНК, образующаяся в ходе полуконсервативной репликации, защищена от действия собств. клеточных рестриктаз благодаря модификации матричной цехш. [c.259]

Т 2, Т4 и Тб) вместо цитозина входит оксиметилцитозин, большин-ст во остатков которого к тому же еще глюкозилированы. ДНК, мо-ди фицированную подобным образом, не разрезают почти все известные рестриктазы. Такой способ борьбы с рестрикцией могут позволить себе лишь крупные фаги, поскольку для этого фаг должен кодировать фактически новый метаболический путь синтеза необычных нуклеотидов, а также новые ферменты синтеза ДНК, адаптированные к необычным свойствам фаговой матрицы и к использованию необычного субстрата. Зато столь радикальная модификация ДН К позволяет фагам, использующим эту тактику, не только защищаться от хозяйских рестриктаз, но и пойти дальше они коди-р уют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, но не действующие на фаговую ДНК. Другие фаги используют еще ряд способов борьбы с системой рестрикции хозяина. [c.133]

Для концевого мечения ДНК-фрагментов -независимо от характера образующихся после эндонуклеазной обработки концов (5 -, 3 -выступающих или тупых) - можно использовать реакцию замещения, катализируемого ДНК-по-лимеразой Т4. В этом случае к препарату кос-мидной ДНК, обработанной рестриктазой, добавляют ДНК-полимеразу и один меченый дезоксинуклеотид (рис. 20.20). Под действием З -экзонуклеазной активности ДНК-полимера-зы происходит последовательное отщепление 3 -концевых нуклеотидов. Процесс продолжается до тех пор, пока в противопложной цепи не экспонируется нуклеотид, комплементарный меченому дезоксинуклеотиду, добавленному в реакционную смесь. Далее включается полимеразная активность ДНК-полимеразы, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый нуклеотид. Поскольку другие нуклеотиды в реакционной смеси отсутствуют, дальнейшего роста цепи не происходит. [c.463]

При необходимости рекомбинантную плазмидз выделяют из клетки, а требуемый фрагмент вырезают иэ нее действием двух рестриктаз, как показано на рисунке 210- Если синтезируется очень длинная последовательность, то синтез планируют таким образом, чтобы можно было клонировать составные части по-следовательности (модули) по отдельности- [c.373]

В суперспирализованном состоянии длинные палиндромы (10 и более пар оснований) образуют крестообразные структуры, служащие сигналами для узнавания определенных участков ДНК ферментами-метилазами, рестриктазами и регуляторными белками, регулирующими действия генов [c.164]

Примером рестриктаз класса 2, специфически расщепляющих ДНК, может служить рестриктаза oRI, действие которой поясняется ниже. Последовательность, распознаваемая этим ферментом, состоит из шести пар оснований, образующих палиндром (в двух цепях последовательности одинаковые, но идут в противоположных направлениях). [c.469]

Рис. 24.9. При расщеплении сателлитной ДНК мыщи рестриктазой E oRII обнаруживаются группы повторяющихся единиц (1, 2, 3), представляющие собой мультимеры фрагмента размером 234 п.п., а также небольшие группы (V2, 1 V2, 2 V2), включающие полуповторы (см. ниже). Пик, находящийся далеко слева, соответствует фракции, устойчивой к действию рестриктаз.

Фаг X также представляет собой хороший пример того, как можно использовать фрагменты, образующиеся при рестрикции (рестрикты) для описания структуры генома вируса. На рис. 9.6 можно видеть число и размеры фрагментов ДНК, образующихся при действии нескольких различных рестриктаз на геном этого фага. Последовательность фрагментов, образующихся при действии определенной рестриктазы, можно определить с помощью сочетания нескольких методов, цель которых состоит в построении карты сайтов рестрикции генома фага X. На рис. 9.7 схематически изображена карта сайтов E o RI и Hin dlll на фоне генетической и физической карт генома фага X. [c.271]

Смотреть страницы где упоминается термин Рестриктазы действие: [c.442] [c.133] [c.518] [c.130] [c.499] [c.500] [c.372] [c.173] [c.190] [c.194] [c.206] [c.74] [c.7] [c.219] [c.28] [c.34] [c.38] [c.48] [c.386] [c.270] [c.272]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология