ДНК-лигаза и образование фосфодиэфирной связи

Д. Образование 3 ,5 -фосфодиэфирных связей с помощью ДНК-лигазы. [c.94]

ДНК-лигаза фага Т4 является мономерным полипептидом с молекулярной массой 68 кДа и катализирует образование фосфодиэфирной связи между прилегающими 5 -фосфатным (5 -р) и 3 -гидроксильным (З -ОН) концами цепей ДНК. При этом возможны два типа реакций. [c.23]

Образование фосфодиэфирной связи между репарированным участком и старыми цепями под действием ДНК-лигазы соединяет две рекомбинировавшие молекулы ДНК ковалентной связью. [c.378]

ДНК-лигаза (DNA lygase) Фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между 3 -гидроксильной группой и 5 -фосфатом соседних нуклеотидов в месте одноцепочечного разрыва молекулы ДНК. [c.548]

РНК-затравочные участки не сохраняются в структуре зрелой ДНК. После реализации своей функции для инициации репликации ДНК они удаляются за счет проявления 5 З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы (рис. 13.1, и 13.3). После удаления РНК-затравки и ее замещения на фрагмент ДНК, инициация синтеза которого происходит на следующей РНК-затравке, расположенной ближе к области репликативной вилки, между дву Мя соседними синтезированными фрагментами ДНК остается разрыв. Этот разрыв (отсутствие ковалентной связи между З -ОН- и 5 -Р04-концами фрагментов цепи) устраняется при участии фермента-ДНК-лигазы,-направляющего образование фосфодиэфирной связи (рис. 13.4). [c.107]

ДНК-лигаза. Фермент, сшивающий полинуклеотиды, путем образования фосфодиэфирной связи между концевым остатком 5 -Р04 одного полинуклеотида и концевым остатком З -ОН другого полинуклеотида, в результате чего образуется единый полинуклеотид большего размера. [c.307]

ДНК-лигазы — ферменты, катализирующие репарацию одноцепочечного разрыва, который обычно возникает под влиянием эндонуклеаз. Поэтому ДНК-лигазы называют еще исшивающими ферментами. Лигазы обнаружены в самых различных клетках, в том числе и в клетках, зараженных вирусами. Под влиянием этих ферментов образуются фосфодиэфирные связи между свободным 5 -фосфатным концом олнго- или полинуклеотида и З -гидроксильной группой соседнего олиго- или полинуклеотида. Скорее всего реакция протекает с обязательным образованием промежуточного комплекса лигазы с АМФ. Например, в клетках кишечной палочки такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с НАД, а в клетках млекопитающих такой комплекс образуется при взаимодейЛвии лигазы с АТФ. Предположительно схему действия ДНК-лигаз можно показать так (рис. 13) Катализируемые ДНК-лигазой ре- [c.51]

Лигирование. Катализируемое ферментом соединение (сшивка) двух фрагментов ДНК или РНК в один путем образования фосфодиэфирной связи. Соответствующие ферменты называются ДНК-(или РНК)-лигазами. [c.51]

A. Ковалентное сшивание липких концов двухцепочечных молекул с помощью ДНК-лигазы. Б. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирных связей в месте одноцепочечного разрыва в двухцепочечной молекуле. [c.222]

ДНК-полимераза I может присоединять дезоксирибонуклеотиды к затравочной цепи, но она не способна катализировать соединение двух цепей ДНК или замыкание одной цепи ДНК. Обнаружение кольцевой ДНК указывало, что такой фермент должен существовать. В 1967 г. в нескольких лабораториях одновременно была открыта ДНК-лигаза - фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между двумя цепями ДНК (рис. 24.30). Фермент этот активен при наличии свободной ОН-группы на З -конце одной цепи ДНК и [c.26]

ПЦР) в присутствии термостабильной ДНК-лигазы, а также всех остальных необходимых кофакторов и ионов. Реакционную смесь прогревают до температуры, оптимальной для лигирования, после чего между отожженными олигонуклеотидами образуется фосфодиэфирная связь, соединяющая оба олигонуклеотида друг с другом. Затем температуру реакционной смеси повышают до температуры плавления гибрида, образованного анализируемой ДНК и лигированными олигонуклеотидами, которые освобождаются в реакционную смесь в составе единого фрагмента. Во время второго цикла температуру реакционной смеси вновь понижают до температуры отжига олигонуклеотидов, которые, находясь в молярном избытке по отношению к освободившимся продуктам реакции, преимущественно гибридизуются с ДНК. Далее, связавшиеся олигонуклеотиды снова лигируют, и образовавшийся продукт реакции освобождают из гибрида повышением температуры. При этом содержание продукта в реакционной смеси удваивается. После проведения п циклов ЛЦР в реакционной смеси теоретически может оказаться пх молекул продукта реакции, где х - число пар олигонуклеотидов, вступающих в реакцию в каждом цикле, теоретически равное числу копий анализируемой последовательности нуклеотидов в реакционной смеси. [c.242]

Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5 -> З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З -конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З -ОН нового фрагмента ДНК и 5 -фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамидадениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов). [c.253]

Примером фермента подкласса 6.5. может служить РНК-лигаза, образующаяся в клетках Е. соИ, инфицированных бактериофагом Т4, ДНК которого содержит генетическую программу для синтеза этого фермента. Этот фермент катализирует образование фосфодиэфирной связи между рибоолигонуклеотидом-донором, имеющим на 5 -конце остаток фосфорной кислоты, и рибоолигонук-леотидом-акцептором, имеющим па 3 -конце свободную 3 -гидроксигруппу, В [c.151]

ДНК- и РНК-лигазы. Существуют ферменты, способные соединять между собой фосфодиэфирной связью целые фрагменты ДНК или РНК. Такие ферменты называются лигазами. Из многочисленного семейства лигаз наибольшее применение получили ДНК- и РНК-лигазы, синтезирующиеся в клетках, инфицированных бактериофагом Т4. Так, Т4 ДНК-лигаза квтализирует образование фосфодиэфирной связи между З -ОН- и б -РО -группами а одноцепочечных разрывах двухцепочечиых ДНК (схема а) или между такими же группами двухцепочечных молекул ДНК, содер жащих на концах комплементарные одноцепочечные последовательности (схема б). [c.352]

ДНК-лигаза. Фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между З -концом одного фрагмента ДНК и 5 -кон-цом другого в условиях, когда оба фрагмента комплементарно спарены с цепью-ма-трицей. [c.1010]

Для изучения сплайсинга тРНК можно использовать бесклеточную систему. Реакция in vitro требует присутствия АТР, й ее можно разбить на два этапа, осуществляя сплайсинг в отсутствие АТР. Первый этап включает расщепление фосфодиэфирной связи, протекающее как необычная нуклеазная реакция. На втором этапе происходит образование связи эта реакция называется сшиванием (лигированием), а осуществляющий ее фермент на-зывается РНК-лигазой. До сих пор не известно, присуши ли нуклеазная и лигазная активности одному ферменту или разным ферментам. Две стадии реакции сплайсинга изображены на рис. 26.3. [c.318]

На фиг. 187 схематически изображен такой процесс репарации тиминовых димеров за счет иссечения и заполнения брешей, предложенный Сетлоу и П. Говард-Фландерсом. По этой схеме одна или несколько молекул ферм-ента постоянно обегают кольцевой бактериальный геном, выискивая в двойной спирали ДНК наличие структурных нарушений, подобно тому как на железных дорогах испытательные вагоны, двигаясь по путям, проверяют рельсы. Когда такой фермент встречает нарушение двойной спирали, обусловленное тиминовым димером, он вызывает два разрыва в полинуклеотидной цепи. В результате происходит иссечение тиминового димера вместе с несколькими соседними нуклеотидами. Образующаяся брешь заполняется под действием репарнрующей ДНК-полимеразы, которой, возможно, является ДНК-полимераза Корнберга (см. гл. IX). Эта полимераза добавляет нуклеотиды к З -ОН-концу нуклеотида в старой полинуклеотидной цепи и использует в качестве матрицы неповрежденную комплементарную цепь ДНК, в которой в этом участке не произошло образования ультрафиолетового повреждения . Наконец, восстановление двойной спирали ДНК завершается образованием фосфодиэфирной связи между З -ОН-концом последнего нуклеотида, включенного при репарационной репликации, и 5 -ОН-концом нуклеотида на конце старой полинуклеотидной цепн. Эта реакция осуществляется ДНК-лигазой, действие которой показано на фиг. 104. [c.377]

Наиболее простой и широко применяемый метод соединения фрагментов ДНК — это отжиг фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазой, образующей липкие комплементарные однонитевые, концы, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, т. е. восстанавливает ковалентную непрерывность цепей ДНК (см. рис. 19). Наличие липких концов не является обязательным условием для воссоединения фрагментов ДНК-лигазой. Так, ДНК-лигаза, кодируемая фагом Т4 (но не лигаза Е. oli), способна соединять и полностью двунитевые фрагменты. Однако, для того чтобы эта реакция протекала эффективно, необходимо наличие высокой концентрации ДНК и значительно большей (приблизительно в 10 раз) концентрации фермента. [c.141]

Наиболее изучены ДНК-лигазы клеток Е. со и фага Т4 с молекулярными массами, соответственно, 74 и килодальтон. Энергию, необходимую для образования ковалентных связей, эти ферменты черпают у кофакторов — макроэргов NAD (никотин-амидадениндинуклеотид, бактериальная лигаза) или АТР (фаговая лигаза). В обоих случаях ферменты аденилируются, а затем переносят АМР на 5 р-концы полинуклеотидных цепей в местах разрывов, что сопровождается восстановлением макроэргических пирофосфатных связей. Запасенная таким образом энергия тратится на образование фосфодиэфирных связей между соседними З ОН- и 5 р-концами, что приводит к залечиванию ников и освобождению АМР [c.174]

NAD+ участвует в нескольких необычных реакциях, в которых не используются окислительно-восстановительные свойства этого кофермента. ДНК-лигаза из Е. соИ, катализирующая образование фосфодиэфирной связи между сшиваемыми 5 -фосфатным концом и З -гидроксидным концом двух полидезоксирибонуклеотидов, осуществляет эту реакцию дегидратации с участием комплекса аде-нилил-фермент этот комплекс образуется наряду с никотинамид-мононуклеотидом прп расщеплении пирофосфатной связи NAD+ под действием ДНК-лигазы (гл. 25). Некоторые ферменты, очевидно, являются различными формами обычной NAD+нуклеозида-зы (гл. 24), которая гидролизует N-рибозильную связь NAD+ с освобождением никотинамида и аденозилпирофосфорилрибозы (ARPPR) [c.471]

Кроме ДНК-полимераз, обладающих у прокариот к тому же нуклеазной активностью, в биосинтезе ДНК принимает участие ДНК-лигаза. Она открыта в 1967 г. одновременно в пяти лабораториях. Это белок с М = 96000. В клетке кишечной палочки, например, насчитывается около 2000 молекул ДНК-лига-зы. Ее функция состоит в обеспечении каталитического ускорения реакции образования фосфодиэфирной связи между 3 - и 5 -концами цепей ДНК, сближенных на расстояние одного нуклеотидного звена и закрепленных на комплементарной им, но непрерывной другой цепи ДНК. Такая ситуация возникает во многих случаях при устранении разрывов в одной из цепей ДНК, вызванных облучением, действием нуклеаз и т.п. при соединении новообразованного при репарации или в процессе нормальной репликации фрагмента с предшествующими или вновь созданными при этом фрагментами ДНК при ковалентном замыкании линейной молекулы ДНК в кольцевую структуру и т. п. Механизм ДНК-лигазной реакции представлен на рис. 84. ДНК-лигаза нашла применение в работах по синтезу генов и их фрагментов. [c.251]

Чтобы лигирование было успешным, в объединяемых цепях должен произойти отжиг комплементарных ( липких ) концов в этом случае происходит лигирование обеих цепей (рис. 4.17, А). Если два одно цеп очечных сегмента удерживаются рядом за счет образования водородных связей с интактной комплементарной цепью, то образование фосфодиэфирной связи происходит только в одной цепи (рис. 4.17, F). ДНК-лигаза фага Т4 (но не лигаза Е. olt) способна также соединить двухцепочечные молекулы с тупыми концами (хотя и с низкой эффективностью), катализируя образование фосфодиэфирных связей в обеих цепях (рис. 4.17, В). [c.222]

Рассмотрим механизм этой реакции, установленный Робертом Леманом (Robert Lehman). АТР или NAD " вступают в реакцию с ДНК-лигазой и образуют ковалентный комплекс фермент-АМР, в котором АМР связан с е-аминогруппой лизинового остатка фермента фосфоамидной связью (рис. 24.31). Остаток АМР активирует фосфатную группу на 5 -конце ДНК. Последняя стадия - нуклеофильная атака активированного атома фосфора З -ОН-группой. В результате образуется фосфодиэфирная связь и освобождается АМР. Движущая сила этой последовательности реакций - гидролиз пирофосфата, отщепляющегося при образовании комплекса фермент—адени-лат. Таким образом, на образование фосфодиэфирной связи в остове ДНК расходуют- [c.26]

Щелочные фосфатазы бактерий (ВАР) и кишечника теленка ( IAP) катализируют удаление 5 -фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению З -концевой радиоактивной метки З2р а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5 -концевого фосфата. Удаление 5 -концевых фосфатных групп молекул вектора, линеаризованных с помощью одной рестриктазы во время подготовки его для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки. Гены секретируемых щелочных фосфатаз находят применение и в качестве высокочувствительных генов-репортеров при исследовании функционирования регуляторных элементов различных генов в прокариотических и дрожжевых системах экспрессии, а также в клетках млекопитающих [91]. [c.65]

Нри репликапии ДНК две пепи двойной спирали расплетаются и расходятся по мере того, как синтезируются новые пепи. Каждая родительская пепь служит матрицей для образования новой комплементарной цепи. Таким образом, репликация ДНК полуконсервативна - каждая дочерняя молекула получает одну цепь родительской молекулы ДНК. Репликация ДНК-сложный процесс, в осуществлении которого участвует много белков, в том числе ДНК-полимеразы трех типов и ДНК-лигаза. Активированные предшественники синтеза ДНК-четыре дезокси-рибонуклеозид-5 -трифосфаты. Новая цепь синтезируется в направлении 5 —>3. Этот синтез осуществляется путем нуклеофильной атаки внутреннего атома фосфора очередного дезоксинуклеозидтрифосфата 3 -гидроксильным концом цепи затравки. Самое важное состоит в том, что ДНК-по-лимераза катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание очередного нуклеотида комплементарно основанию матричной цепи. Другими словами, ДНК-полимеразы — ферменты, направляемые матрицами. ДНК-полимеразы I, II и III обладают также 3 —>5 -экзонуклеазной активностью, которая увеличивает надежность репликации путем удаления не комплементарных остатков. ДНК-полимеразам I и Ш присуща, кроме того, 5 —>3 -нуклеазная активность, играющая важную роль в механизмах репликации и репарации ДНК. [c.43]

Как цитозиновые, так и адениновые основания спонтанно дезаминируются с образованием урацила и гипоксантина соответственно. Поскольку в норме ДНК не содержит ни урацила, ни гипоксантина, нет ничего удивительного в том, что специфические N-гликозилазы узнают эти аномальные основания и удаляют нх. Образовавшийся разрыв служит сигналом для действия репарационных пурин- или пи-римидинспецифичных эндонуклеаз, расщепляющих фосфодиэфирную связь возле соответствующего участка повреждения. После этого при последовательном действии экзонуклеазы, репарационной ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы происходит заполнение бреши и восстановление исходной правильной структуры (рис. 38.22). Эта цепь событий получила название эксцизионной репарации. Сходным образом происходит процесс репарации ДНК, содержащей алкилированные основания и аналоги оснований. [c.80]

Ковалентное присоединение происходит в том случае, когда два смежных участка одного олигонуклеотида (3) комплементарны крайним фрагментам других олигонуклеотидов (I и 2), которые благодаря комплементарным взаимодействиям укладываются на первом как на матрице. При этом концы их фиксируются так, что их положение максимально благоприятно для образования ковалентной фосфодиэфирной связи. После того как лигаза соединит эти два конца, образуется двзгоггевая ДНК-подобная структура, состоящая из олигонуклеотидов 3 и 4. Соединения 3 и 4 выделяют и используют для даль- [c.59]

Получение рекомбинантных молекул ДНК включает объединение in vitro сегаентов ДНК из различных источников. Благодаря тому что при расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами образуются фрагменты с липкими концами, при отжиге эти фрагменты довольно легко соединяются, однако водородные связи, удерживающие их вместе, в обычных условиях оказываются относительно слабыми и легко разрушаются. Для ковалентного сщи-вания фрагментов используют ДНК-лигазу, которая катализирует образование фосфодиэфирных [c.222]

В. Одноцепочечные интервалы в повторах ССССАА по большей части представляют собой пропуск одного нуклеотида. Поскольку при денатурации высвобождаются одноцепочечные фрагменты (наблюдение 4), то должны быть разрывы в фосфодиэфирном скелете. Вероятно, эти разрывы содержат З -ОН, поскольку они служат сайтами для синтеза ДНК (наблюдения 1, 3 и 7), однако они не могут быть простыми разрывами 5 -Р04 с З -ОН, так как обработка мини-хромосомы лигазой не приводит к снижению включения нуклеотидов ДНК-полимеразой (наблюдение 2). Природу этих одноцепочечных разрывов можно выявить, если произвести замещение свободных 5 -фосфатов мечеными фосфатами и затем разрушить все связи с пуриновыми нуклеотидами, что приведет к образованию преимущественно фрагмента ССС (наблюдение 5). Этот результат указывает на то, что большинство разрывов представляют собой пропуски одного нуклеотида, а именно первого С(5 -С)-повтора. (Если бы был пропущен З -С в последовательности —ССС—АА—, то метка по 5 -фосфату присоединялась бы к А, а фрагмент ССС оказался бы немеченым.) Длина разрыва скорее всего не больше размера одного нуклеотида, так как ДНК-полимераза может включать меченый С в отсутствие других нуклеотидов (наблюдение 1). (Если бы разрыв соответствовал, например, двум нуклеотидам, то первым нуклеотидом, встроенным ДНК-полимеразой, был бы А.) [c.386]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология