ДНК-лигаза фага

С помощью ДНК-лигазы фага Т4 соединили а1-сайты плазмиды. В результате из середины кодирующей Aj-пептид последовательности оказался удаленным сегмент длиной 550 п. н., соответствующий аминокислотным остаткам 183-194. [c.236]

Сшивание ДНК лигазой фага Т4 по липким концам (лигирование) [c.103]

Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеотидов, получивших наименование линкеры (связывающие звенья) дает возможность клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие тупоконечные (т.е. не обладающие одноцепочечными концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соединяться с произвольными тупоконечными фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9,13), Эти фрагменты могут выстригать- [c.279]

И. Ковалентное соединение с помощью ДНК-лигазы фага Т4 [c.96]

На 1 мкг ДНК добавьте 0,1 ед. ДНК-лигазы фага Т4 или [c.96]

Скорость соединения, катализируемого ДНК-лигазой фага Т4, прямо пропорциональна концентрации лигазы. Поэтому используют высокие концентрации этого фермента. При рекомендуемых концентрациях лигазы реакция завершается за несколько минут. Рекомендуемых 1—6 ч хватает с избытком, однако вреда этот избыток не причинит. [c.97]

Х Буфер для ДНК-лигазы фага Т4 (хранят при —20°С) [c.76]

ЮХ Буфер для ДНК-лигазы фага Т4 5 мкл ДНК (вектор и фрагмент) +НгО до 44 мкл+1 мкл сверхчистой ДНК-лигазы фага Т4 Инкубируют при комнатной температуре 1 ч. [c.82]

Такие дуплексы затем последовательно объединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и внедряют в вектор. [c.256]

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78]

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Рис. 12.20. Синтетический олигонуклеотид, послуживший основой для создания гена адгезивного белка, синтезируемого мидией М. edulis. Второй синтетический олигонуклеотид был синтезирован таким образом, чтобы после отжига с первым образовывался фрагмент двухцепочечной ДНК с липкими концами. Последующее лигирование с помощью ДНК-лигазы фага Т4 привело к образованию линейной ДНК, состоящей из представленных на рисунке повторов. Внизу дана аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого этим повтором.

Лигирование (Ligation) Соединение двух молекул ДНК с помощью фосфодиэфирных связей. In vitro катализируется ферментом ДНК-лигазой фага Т4. [c.552]

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестрик-тазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантнук> молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. В случае плазмиды pBR322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечить, устойчивость. [c.317]

И. ДНК-лигаза фага 14 из лизата клеток Е. соИ Е1150 (см. список штаммов) [c.139]

В состав реакционной смеси для лигирования в объеме 10 мкл входят 1,5 мкг (4 мкл) ДНК после фракционирования по размерам, 1,5 мкг векторных фрагментов рННЬ (2 мкл 6-кратный молярный избыток) и НгО до конечного объема 8 мкл. Смесь инкубируют при температуре 70 °С 8 мин, после чего переносят на 30 мин в ледяную баню. Добавляют 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования и 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Перемешивают на вортексе, центрифугируют в течение короткого времени и инкубируют при 15 °С 2 ч. Результаты лигирования проверяют в 0,6%-ном агарозном мини-геле, нанося образец вместе с нелигированной векторной ДНК и маркерными фрагментами ДНК фага X. [c.23]

Примечание. При лигировании тупых концов добавление второго микролитра ДНК-лигазы фага Т4 после 30-минутной инкубации увеличивает число лигированных молекул. [c.82]

Образование делеций. Ранее уже отмечалось, что делеции и вставки размером в несколько десятков нуклеотидных пар можно получить методами с использованием олигонуклеотидов. Делеции и вставки размером в несколько нуклеотидных пар можно получить, удаляя выступающие концы рестриктов нуклеазой S1 или заполняя их ДНК-полимеразой. В результате после воссоединения рестриктов ДНК-лигазой фага Т4 в молекулах ДНК появляются микроделеции или микровставки. При желании увеличить размеры делеций концы рестриктов дополнительно обрабатывают подходящими экзонуклеазами. К большим делениям приводит удаление из фрагмента ДНК л тка, находящегося между двумя сайтами рестрикции, последов т " ным действием рестриктазы и лигазы. [c.264]

B. Могут ли концы, появившиеся в результате разрезания ферментом ВатШ, соединиться вновь при инкубации с ДНК-лигазой фага Т4 после того, как была проведена реакция, о которой шла речь в пункте Б [c.42]

Биотехнология (1988) -- [ c.4 , c.317 , c.318 ]

Биотехнология - принципы и применение (1988) -- [ c.4 , c.317 , c.318 ]

Основы генетической инженерии (2002) -- [ c.2 , c.2 , c.9 , c.22 , c.50 , c.174 , c.175 , c.220 , c.242 , c.247 , c.256 , c.265 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология