Условия гибридизации и отмывки фильтров

Условия гибридизации и отмывки фильтров [c.201]

Наиболее критическим моментом в приготовлении отпечатков ДНК с помош,ью зондов на основе ГВР является гибридизация и отмывка фильтров. Оптимальные условия варьируют в зависимости от характера зондов. [c.201]

После гибридизации промойте фильтр при 65 С 3 раза по 30 мин 500 мл раствора, содержащего 2Х85С, 0,1 % (весовая концентрация) ДСН, а затем один раз в растворе 0,1х38С, 0,1% ДСН. Условия последней жесткой отмывки могут быть изменены в зависимости от требований, предъявляемых к специфичности зонда. Иногда целесообразно изменить температуру или концентрацию солей. [c.28]

Наличие в геномах человека и шимпанзе последовательностей, имеющих частичное сходство с различными генами HIV-1, первоначально тестировали с помощью блот-гибридизации в мягких условиях, позволяющих выявлять последовательности, сходство которых с генами ВИЧ составляет от 60% и выше. В очень мягких условиях гибридизации геномных ДНК человека и шимпанзе с перекрывающимися генами tatirev наблюдали в основном диффузное распределение сигнала. При более жестких условиях отмывки фильтров диффузный гибридизационный сигнал уменьшался и были обнаружены дискретные положительные сигналы как с ДНК человека, так и с ДНК шимпанзе. Наличие дискретных гибридизующихся фрагментов не исключает существование и других последовательностей, имеющих сходство с генами tat/rev, которые представлены менее часто встречающимися фрагментами других размеров. Об этом свидетельствуют полуколичественные данные гибридизации в точках, согласно которым общее число tatlrev-no-добных элементов в геноме человека составляет около 10 . Сходное значение было получено и при скрининге тотальной библиотеки генов человека (102-103). Эти оценки совпадают с теми, которые можно рассчитать на основании данных гибридизации с фильтрами высокой плотности, на которых нанесен ранжированный банк генов хромосомы 19. Около десятка рекомбинантных космид гибридизовалось в мягких условиях с зондом tatirev. Учитывая, что хромосома 19 содержит примерно 1/50 часть генома, можно рассчитать, что общее количество тг/геу-подобных элементов в геноме человека составляет около 5 х Ю . [c.173]

В геноме человека с помошью гибридизации в мягких условиях обнаружено также множество нуклеотидных последовательностей, имеющих частичную гомологию с другим регуляторным геном HIV-1 - nef. При гибридизации геномных ДНК с зондом, содержащим ген nef часть длинного концевого повтора (LTR) HIV-1 и часть гена env, были выявлены последовательности, имеющие частичную гомологию с HIV-1, которые диспергированы в геномах как у человека, так и у мыши. Сходную картину наблюдали и при гибридизации с ДНК шимпанзе. По мере ужесточения условий гибридизации и отмывки фильтров наблюдали постепенное уменьшение сигнала на автографах, что свидетельствовало о наличие у разных классов млекопитающих гетерогенного семейства геномных последовательностей, имеющих частичную гомологию с использованным зондом. [c.174]

Следует отметить, что необходимым условием осуществления мультиплексного секвенирования ДНК является перенос фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на мембранный фильтр, поскольку проведение всех этих последовательных процедур гибридизации, окрашивания, отмывки возможно только с мембранным фильтром. Второе условие заключается в прочной сорбции фрагментов ДНК на данном фильтре, выдерживающей многократные инкубации в различных растворах. В противном случае мультиплексное секвенирование будет просто невозможно. Немаловажное значение имеет тип используемой метки. Так, при использовании радиоактивной метки процесс выявления последовательностей всех матриц ДНК довольно продолжителен ввиду требующейся длительной экспозиции фильтра на рентгеновскую пленку, занимающей иногда несколько суток. Гораздо быстрее результаты могут быть получены с помощью хемилюминесценции такого субстрата, как 1,2-диоксетан. Считается, что каждый цикл мультиплексного секвенирования с его использованием требует 1 ч на гибридизацию с меченой пробой и 1,5 ч на все процедуры по выявлению гибридизационных сигналов [ reasey et al., 1991]. [c.299]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология