Геномная библиотека, скрининг помощью гибридизации

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отнощению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК, присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0,lXSS , 0,1%-ноге ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов). [c.35]

Наличие в геномах человека и шимпанзе последовательностей, имеющих частичное сходство с различными генами HIV-1, первоначально тестировали с помощью блот-гибридизации в мягких условиях, позволяющих выявлять последовательности, сходство которых с генами ВИЧ составляет от 60% и выше. В очень мягких условиях гибридизации геномных ДНК человека и шимпанзе с перекрывающимися генами tatirev наблюдали в основном диффузное распределение сигнала. При более жестких условиях отмывки фильтров диффузный гибридизационный сигнал уменьшался и были обнаружены дискретные положительные сигналы как с ДНК человека, так и с ДНК шимпанзе. Наличие дискретных гибридизующихся фрагментов не исключает существование и других последовательностей, имеющих сходство с генами tat/rev, которые представлены менее часто встречающимися фрагментами других размеров. Об этом свидетельствуют полуколичественные данные гибридизации в точках, согласно которым общее число tatlrev-no-добных элементов в геноме человека составляет около 10 . Сходное значение было получено и при скрининге тотальной библиотеки генов человека (102-103). Эти оценки совпадают с теми, которые можно рассчитать на основании данных гибридизации с фильтрами высокой плотности, на которых нанесен ранжированный банк генов хромосомы 19. Около десятка рекомбинантных космид гибридизовалось в мягких условиях с зондом tatirev. Учитывая, что хромосома 19 содержит примерно 1/50 часть генома, можно рассчитать, что общее количество тг/геу-подобных элементов в геноме человека составляет около 5 х Ю . [c.173]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология