Другие методы последовательного отщепления

Другие методы последовательного отщепления [c.452]

Удалось разработать также химические методы последовательного отщепления аминокислот от белков и полипептидов. В условиях такого контролируемого разложения можно отщеплять одну за другой аминокислоты, стоящие у аминного или карбоксильного конца полипептидной цепи. [c.41]

Предложены и другие методы последовательного С-концевого анализа [54, 61, 67]. Для С-концевого последовательного отщепления использовали алкоголиз оксазола (разд. 18.3.5) [68]. В этом случае еще предстоит преодолеть проблемы снижения [c.506]

Проведение подобных исследований значительно облегчается присоединением радиоактивной метки к концу цепи. Один из методов, ныне широко распространенных, заключается в том, что концевой нуклеозид РНК окисляют перйодатом, подобно тому как это делают в методе последовательного отщепления (фиг. 20), а затем образовавшийся диальдегид восстанавливают боргидридом натрия (NaBHi), меченным Н [373]. Существует и другой [c.99]

Другие аминокислоты входят в цикл при помощи ацетил-КоА. Это вещество играет важную роль в подготовке жиров к окислению. Жиры, расщепляющиеся гидролитически под влиянием липаз, дают жирные кислоты и глицерин. Глицерин образует глицерофосфат и в гликолитической системе превращается в пировиноградную кислоту. Механизм окисления жирных кислот долгое время был предметом споров. В настоящее время имеются данные, полученные изотопными методами, которые позволяют с большой уверенностью принять схему, очень похожую на схему Кноопа, предложенную им еще в начале XX в. [3]. Существенным дополнением схемы Кноопа является введение в нее KoA-SH и разъяснение характера действия различных ферментов. Основной особенностью процесса надо считать последовательное отщепление от молекулы жирной кислоты двухуглеродных фрагментов, получающихся в виде ацетильного производного КоА. [c.110]

С другой стороны, было показано, что если использовать методы модифицирования, повышающие содержание протонных центров, такие, как увеличение глубины декатионирования, степени обмена натрия на кальций или содержания добавок HjO, то активность цеолитов возрастает. С учетом всех этих данных Холл и сотр. пришли к выводу, что в процессе изомеризации происходит образование бшо -бутил-катиона и через этот карбониевый ион путем последовательного присоединения и отщепления протона могут осуществляться взаимные превращения всех изомеров бутена. [c.69]

В разделе УП, Г, 1 уже были приведены доказательства в пользу предложенных механизмов масс-спектрометрических и фотохимических реакций, ведущих к отщеплению олефина от кетона [уравнение (120)]. Приняв енольную форму осколочного иона в этой реакции, можно обсудить ее механизм теоретически. По-видимому, реакция включает две стадии перенос водорода и отщепление олефина. Делались различные предположения о том, являются ли эти два процесса действительно последовательными стадиями или реакция имеет синхронный механизм. Из вычислений методом самосогласованного поля следует, что реакция протекает ступенчато. Из расчетов методами теории возмущений и теории молекулярных орбиталей с учетом валентных электронов, наоборот, следует, что реакция идет синхронно [237]. Эти результаты существенно зависят от подлежащих уточнению параметров, которые приходится вводить в уравнения. Одна совокупность таких параметров может случайно оказаться лучше, чем другая. [c.108]

Существующие методы деградации более пригодны для изучения нуклеотидной последовательности РНК. Это обусловлено особенностями ее структуры, а именно наличием а-диольной группировки у Сг- и j-, что создает предпосылки для разработки методов, основанных на химической модификации этой группировки и последующем ступенчатом отщеплении концевых модифицированных звеньев цепи. С другой стороны, известны высокоспецифичные РНК-азы, позволяющие проводить избирательное расщепление РНК до олигонуклеотидов. В настоящее время [c.388]

Данные, полученные с помощью непрямых методов — торможения серологической и ферментативной активности простыми соединениями известного строения и последовательного ферментативного расщепления,— дают очень ценную информацию о природе детерминантных групп в веществах крови. Однако более однозначные данные можно получить путем выделения и идентификации активных фрагментов непосредственно из групповых веществ. Фрагменты, выделенные из продуктов частичного кислотного гидролиза групповых веществ крови человека. Отщепление от групповых веществ крови фукозы и сиаловой кислоты в условиях кислотного гидролиза, при которых происходит лишь незначительное отщепление других компонентов, указывает на то, что эти сахара являются концевыми или имеют латеральное расположение по отношению к основным углеводным цепям. При гидролизе групповых веществ крови человека 1 н. уксусной кислотой при 100° в течение 16 час независимо от их специфичности освобождается около 95% общей фукозы в виде свободного сахара [53]. Обработка групповых веществ Ье кислотой в очень мягких условиях (0,1 н. серная кислота, 80°, 1 час) приводит к освобождению всей сиаловой кислоты [68]. В продуктах частичного кислотного гидролиза групповых веществ олигосахариды, содержащие фукозу или сиаловую кислоту, не найдены если такие олигосахариды и образуются, то, очевидно, в очень незначительных количествах. [c.198]

Методы определения аминокислотной последовательности полипептидных цепей хорошо отработаны. На многих стадиях исследования применяются автоматизированные процедуры анализа, особенно при проведении поэтапного отщепления концевых аминокислотных остатков, начиная с Ы-конца. В благоприятных случаях можно определить последовательность 60 и большего числа остатков почти без вмешательства исследователя. Таким образом, для многих небольших белков определение аминокислотной последовательности является теперь едва ли не рутинной операцией. Для крупных белков или белков, обладающих плохой растворимостью, эта задача более сложна. Однако, как правило, если необходимо знать последовательность белка и есть готовность выполнить требующуюся работу, окончательный успех почти гарантирован. Относительная простота определения последовательности остатков сразу же вызывает два вопроса какую информацию можно непосредственно извлечь из последовательности и как эти данные могут пригодиться при проведении других экспериментальных исследований [c.65]

Другой подход к решению задачи об установлении последовательности мономеров в НК связан с развитием методов последовательного отщепления мономеров с одного из концов полимерной цепи. Хотя трудно представить, чтобы этим путем можно было осуществить деструкцию полимера, содержащего тысячу и более мономерных единиц, что имеет место в природных НК, однако значение этого пути несомненно хотя бы для установления строения олигонуклеотидов, получающихся при частичном разрыве полимерной цепи. В настоящее время известны подходы к решению этой задачи как для полирибонуклеотидов, так и для полидезоксирибонуклеотидов. [c.252]

С помощью химического метода последовательного отщепления мононуклеотидов удалось показать присутствие последовательности Gp p p pA на З -конце РНК вируса табачной мозаики этот результат был подтвержден и другим методом Сочетанием [c.81]

Последоаательность аминокислот и первичная структура белков. Основным направлением при изучении химического строения белков является выяснение последовательности расположения аминокислотных остатков в белковых молекулах, т. е. установление их первичной структуры. Подходы для изучения последовательности расположения аминокислотных остатков в молекуле белков были разработаны главным образом в работах Ф. Сэнгера (1956) . Для изучения строения инсулина Ф. Сэнгер использовал два метода. Первый метод — последовательное отщепление одного аминокислотного остатка за другим от азота или углерода концевого участка полипентидной цепи второй метод — расщепление молекулы белка на ряд более мелких облом- [c.32]

Некоторые ферменты катализируют последовательное отщепление аминокислот с одного или другого конца пептидной цепи. Карбоксипеп-тидазы отщепляют аминокислоты с карбоксильного конца, а аминопеп-тидазы атакуют противоположный конец. Используя хроматографические методы, можно определить, какие аминокислоты были отщеплены этими ферментами в заданные моменты времени, и получить представление о последовательности аминокислот на концах цепи. [c.168]

Сканирующая микрокалориметрия выявляет в ряде случаев последовательность пиков теплоемкости при плавлении глобулы. На рис. 4.23 приведена кривая плавления Лиз-плазминогена (Привалов и сотрудники). Ясно видны три пика теплоемкости. Это может свидетельствовать о раздельном плавлепин доменов в глобуле или об отщеплении ионов Н" , происходящем при разных температурах в разных участках. В сочетании с рентгенографией и другими методами микрокалориметрия дает полезную информацию. [c.118]

При действии карбоксипептидазы также можно проследить последовательное отщепление аминокислоты с карбоксильного конца полинептидной цепи и таким образом определить порядок соединения аминокислот в белковой моле суле. Применимость метода ограничивается тем, что пептиды, несущие на карбоксильном конце пролин, оксипролин, аргинин, лизин и, гюзможио, глицин, не расщепляются карбоксипептидазой. Для расщепления низкомолекулярных полипептидов используются также и другие пептидазы. [c.41]

На данной стадии синтеза использован метод Дарзана й Менцера [1]. Он был разработан для последовательного расщепления кислот (уменьшение каждый раз на один углеродный атом) с таким расчетом, чтобы процесс можно было непрерывно повторять. Выход следующей низшей кислоты составляет 50— 75%, причем в процессе отщепления не вводится посторонний атом углерода. Углерод отрывается, по-видимому, в виде карбоксила бензойной кислоты, которая может быть выделена с очень хорошим выходом при работе с небольшими количествами. В статье авторов синтеза рассмотрены другие методы расщепления жирных кислот. [c.81]

Изучение строения белков намного сложнее, чем каучука, целлюлозы и синтетических полимеров, так как в отличие от последних макромолекула белка состоит не из одинаковых повторяющихся мономерных звеньев, а из остатков более 20 различных аминокислот. При выяснении структуры белков поэтому необходимо было установить не только число и природу остатков, но также и порядок их чередования в макромолекуле. Для решения этой задачи производят последовательное отщепление аминокислот с того или другого конца полимерной молекулы с последующей идентификацией их. В методе Эдмана, например, белок обрабатывают раствором фенилизо-тиоцианата в пиридине и полученный продукт присоединения — раствором НС1 в нитрометане. При этом концевой остаток отщепляется в виде соответствующего фенилтиогидантоина без изменения остальной части макромолекулы [c.242]

В общих чертах стратегия Сенгера сохранила свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия были разработаны два новых подхода, которые произвели революцию в определении первичной структуры полипептидов (белков). Первый подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г. автоматической процедуре последовательного отщепления и идентификации N-кoнцeвыx аминокислотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых производных. Второй подход связан с методом, разработанным Сенгером и, независимо, Максамом и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое и однозначное секвенирование гена, кодирующего рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия состоит в одновременном использовании обоих подходов. Автоматическая деградация по Эдману, намного более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом Сенгера, тем не менее сильно уступает по скорости методам секвенирования ДНК и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную первичную структуру исследуемого белка. Главным [c.38]

Другие методы определения последовательности расположения аминокислотных остатков в белковой молекуле основаны главным образом на использовании ферментов, способных ускорять реакции последовательного отщепления аминокислот либо с N-, либо с С-конца полипептидной цепи. Однако они не получили еще столь широкого распространения и аппаратурного оформления, как рассмотренные выше. В последние годы ведущее место в выяснении первичной структуры белков занял метод, который условно можно назвать генетическим он основан на выведении последовательности аминокислот в белковой молекуле исходя из структуры гена, кодирующего биосинтез этого белка. Именно так была расшифрована структура самых длинных полипептидных цепей—фактора VIII свертывания крови (2332 аминокислотных остатка) и субъединицы тиреоглобулина (2750 аминокислотных остатков). Нельзя не упомянуть также только что появившиеся сообщения об определении первичной структуры белков методом лазерной фотодиссоциации учитывая его высочайшую чувствительность (для анализа достаточно 5 нмоль белка при молекулярной массе 50 кДа), он, по-видимому, имеет большое будущее. [c.59]

В пользу тетрациклического строения. Обычные методы определения длины боковой цепи в данном случае непригодны. Наиболее интенсивный ион в области с М/е =217 позволяет сделать вывод, что боковая цепь содержит 11 атомов углерода. На основании известных свойств аналогичных соединений наличие цепи такой длины невероятно. Анализ масс-спектрй показывает, что в отличие от стероидов имеется последовательность пиков, отвечающих массам 217, 229, 243, 257, 273, 287 и 301, с максимумом при массе 257. Используя эту величину при определении длины боковой цепи, получим С8Н17, что является правильным результатом. Поэтому в отличие от стероидов исследуемая молекула содержит три дополнительных атома углерода, присоединенных к кольцевой системе. В масс-спектре имеется другой пик почти такой же интенсивности, который соответствует иону с М1е= 273. Образование подобного иона лучше всего можно объяснить отщеплением метильной группы с одновременным перемещением водорода. [c.60]

Конингсберг и Хилл ввели важное усовервгенствование в этот метод, а именно хроматографическое разделение очищенного деградированного пептида, что открыло возможность идентификации отщепленной N-концевой аминокислоты путем сравнения результатов аминокислотного анализа исходного и деградированного пептида. Благодаря этому реактив Эдмана занял теперь центральное место в арсенале средств, используемых для установления последовательности аминокислот. Определение концевой аминокислоты можно повторять многократно, идентифицируя один N-концевой остаток за другим (после того как будет отщеплен предыдущий). Теоретически так можно пройти по всей пептидной цепи, однако на практике приходится сталкиваться с трудностями, которые вынуждают ограничиться примерно пятью успешными определениями. [c.87]

Как химические, так и ферментативные методы определения последовательности нуклеотидов поочередным отщеплением концевых мономеров полинуклеотидной цепи имеют свои ограничения при химическом методе это связано с неколичественным протеканием процесса и частичным расщеплением псевдоуридина под действием перйодата, при ферментативном — с отдельными разрывами фосфодиэфирных связей в середине полинуклеотидной цепи (за счет примесей других ферментов). Вследствие этого редко удается определить таким образом последовательности более 5—6 остатков нуклеотидов метод, однако, широко применяется для анализа олигонуклеотидов, образующихся при частичном расщеплении цепи РНК. [c.68]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

В этом методе индивидуальные аминокислоты идентифицируют одну за другой по мере их отщепления. Многосторонность такого подхода к изучению аминокислотной последовательности привела к его возрастающему использованию вместо методики с фтординитробензолом. [c.154]

Имеются два общих подхода к осуществлению внутриклеточной экспрессии клонированных генов. Соответствующий ген может быть клонирован в одной рамке считывания с синтетическими или бактериальными кодирующими последовательностями и экспрессироваться с образованием гибридного белка. Другой способ — непосредственная экспрессия встроенного гена. Потребность в экспрессии эукариотических полипептидов в составе гибридных белков возникла, когда было обнаружено, что уровень экспрессии эукариотических белков в клетках Е. oli ограничивается по той причине, что они распознаются клеткой как чужеродные и разрушаются [9]. Это особенно наглядно проявилось в случае полипептидов небольшого размера. При сшивании эукариотического гена с бактериальным синтезировались гибридные продукты, которые накапливались в клетке в значительно больших количествах [10, 11]. Однако, если требуется получить эукариотический полипептид в чистом виде, возникает необходимость в методе, позволяющем правильно расщепить гибридный белок. С другой стороны, непосредственная экспрессия одного эукариотического гена дает возможность получить нужный белковый продукт. Однако первичные продукты трансляции несут на своем Ы-конце остаток метионина. В клетках Е. соН имеются ферменты, осуществляющие при необходимости эффективное отщепление метионина от природных белков однако в случае рекомбинантных белков эти ферменты работают не столь эффективно [1]. Таким образом, белки, полученные в результате прямой экспрессии эукариотического гена, могут содержать несвойственный природному белку N-концевой метионин. [c.98]

ТФ-подход значительно стимулировал развитие работ по тиоцианатному расш еплению, хотя до сих пор не удавалось отщепить более 6 аминокислот. Особые сложности возникают при анализе как самих остатков Asn, Asp, Glu, Pro, так и остатков, следующих за ними. Pro отщепляется на первой же операции своего цикла отщепления (обработка тиоцианатом аммония), поэтому вместе с ним в продуктах того же цикла появляется следующая аминокислота [58]. Отщепление других вышеприведенных аминокислот происходит с низкими выходами. Идентификацию тиогидантоинов проводили различными методами без использования преимуществ высокочувствительной фотометрии. Трудно оценить возможность определения длинных участков последовательности без проведения дополнительной вдумчивой и систематической работы. Мы надеемся, что подобное исследование будет продолжено, так как С-концевые отщепления могут очень полезно дополнять анализ N-концевой последовательности. Кроме того, количественное присоединение пептидов по а-аминогруппе к нерастворимому носителю происходит в целом значительно легче, чем конденсация по С-концевому карбоксилу. [c.455]

Два главных препятствия до сих пор ограничивают пределы возможностей автоматического ЖФ-метода Эдмана [32]. Первой проблемой является перенос остаточных аминокислот на каждый последующий цикл. Это явление происходит как из-за неполного присоединения реагента к белку, так и из-за неполного отщепления модифицированной N-концевой аминокислоты в виде 2-анилинотиазолинона другая проблема заключается в том, что па стадии кислотной обработки карбамоилпеп-тида (белка) происходит расщепление внутренних неустойчивых пептидных связей, приводящее к появлению новых полипептидных цепей, т. е. новых последовательностей. В результате этих двух процессов накопление фона ФТГ-аминокислот достигает такого уровня, что однозначная идентификация последовательности аминокислот основной цепи становится невозможной, Для снижения уровня остаточных пиков было предложено проводить и конденсацию, и отщепление АТЗ дважды в каждом цикле [31]. Однако такое изменение стандартной методики приводит к большим потерям пептида (вымывание из реактора). Для снижения этих потерь в реактор добавляют носители-белки или органические полимеры [78, 92], но, к сожалению, белки подвержены ацидолизу, в результате чего возникают ложные последовательности. Для снижения уровня остаточных аминокислот, появляющихся в результате неполного взаимодействия ФИТЦ с полипептидами (особенно если Pro—N-концевой остаток), повышают температуру реактора до 55°С [94]. [c.456]

Смотреть страницы где упоминается термин Другие методы последовательного отщепления: [c.411] [c.263] [c.91] [c.73] [c.494] [c.91] [c.339] [c.384] [c.171] [c.198] [c.193] [c.357] [c.198] [c.480] [c.196] [c.366] [c.69] [c.439] [c.271] [c.447]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология