Секвенирующий гель

Секвенирующий гель (Sequen ing gel) Длинная пластина полиакриламидного геля, позволяющая проводить электрофоретическое разделение олиго- и полинуклеотидов, различающихся по длине всего на 1 нуклеотид. [c.559]

Открытие возможности избирательной амплификации определенных участков ДНК с помощью полимеразной цепной реакции [Saiki et al., 1985, 1988] оказало чрезвычайно сильное влияние на всю молекулярную биологию, включая и секвенирование ДНК. До появления этого метода можно было секвенировать только рекомбинантные молекулы ДНК (кроме некоторых частных случаев). Причина этого кроется в низком содержании в геноме какой-либо определенной, даже повторяющейся, последовательности и невозможности детекции столь малого количества фрагментов ДНК при их секвенировании. Теоретически можно было бы детектировать на радиоавтографе секвенирующего геля полосы ДНК какого-нибудь условного гена, если взять в реакцию около 500 мг тотальной ДНК с ее концентрацией в реакционной смеси приблизительно 50 г/мл. Поскольку такое принципиально невозможно, то для определения последовательности нуклеотидов было необходимо использовать ДНК, обогащенную каким-либо геном или просто определенным участком, что и достигалось ранее посредством клонирования. В связи с достаточной сложностью методов клонирования получение таких рекомбинантных ДНК и их последующее секвенирование было доступно далеко не всем не молекулярно-биологическим лабораториям. Амплификация же определенных фрагментов ДНК с помощью специфических праймеров, приводящая за короткий промежуток времени к наработке значительных количеств нужных участков ДНК, явилась мощной и доступной альтернативой методу клонирования. Таким образом, многие лаборатории, ранее и не помышлявшие о секвенировании ДНК ввиду сложности подготовительных этапов, стали активно использовать этот метод в своих исследованиях. Поэтому можно смело предположить, что удельный вес ПЦР-секвенирования в общем определении нуклеотидных последовательностей различных ДНК будет несомненно возрастать. Что касается тех, кто и так раньше владел методами секвенирования ДНК, то они также взяли на вооружение метод ПЦР-секвениро-вания и занялись разработкой его различных модификаций, рассмотрению которых и будет посвящена данная глава. [c.134]

СЕКВЕНИРУЮЩИЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ [c.168]

Дегазируйте смесь для приготовления геля в вакуум-эксикаторе в течение. нескольких минут. Раствора объемом примерно 75 мл с избытком хватит на приготовление большого (шириной 30 см) секвенирующего геля. Раствор должен иметь комнатную температуру, поскольку при более низкой температуре гель может эаполи.меризоваться недостаточно быстро, чтобы сформировались кар.иашки. [c.32]

Несмотря на кажущуюся простоту, при получении фрагмента ДНК с меткой только на одном конце этим способом, неприятным моментом является необходимость дополнительных этапов обращения с радиоактивно меченным препаратом, заставляющих проявлять особую осторожность ввиду недопущения радиоактивного загрязнения во время осуществления процедур гель-электрофореза и элюции фрагментов ДНК из геля. Однако этот подход является неизбежным при мечении 5 -концов полинуклеотидкиназой. Если мечение 3 -конца еще позволяет получить секвенируемый фрагмент ДНК с различными концами, один из которых практически не будет метиться в одной реакции, то мечение 5 -конца не допускает такой возможности, поскольку, несмотря на существенные различия в эффективности мечения 5 -выступающих и тупых или углубленных концов фрагмента ДНК, все они будут нести метку, что приведет к невозможности прочтения нуклеотидной последовательности с радиоавтографа секвенирующего геля. Уменьшить неизбежный фон и как-то прочитать нуклеотидную последовательность теоретически можно, проведя вначале этап обязательного дефосфорилирования концов фрагмента ДНК, мечение которых предполагается осуществить, затем - этап повторного расщепления другой рестрикционной эндонуклеазой, генерирующей концы, менее удобные для мечения полинуклеотидкиназой, этап элюции из геля и только потом - мечения. Уже простое перечисление всех этих этапов заставляет отказаться от такого варианта и выбрать способ обращения с фрагментом ДНК, несущим оба радиоактивно меченных 5 -конца, предполагаюпщй расщепление еще одной рестрикционной эндонуклеазой, как описано выше. [c.26]

Относительно недавно был предложен новый вариант твердофазного секвенирования ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином [Ohara R., Ohara О., 1995]. Фрагменты ДНК, меченные биотином по 5 -концу с помощью ПЦР, сорбировались на данные магнитные частицы и подвергались реакциям химической модификации и после пиперидинового гидролиза наносились на секвенирующий гель. С помощью магнитных частиц достигалось быстрое и полное удаление реагентов, что не могло не привести к получению высококачественных результатов. [c.39]

При любом методе секвенирования ДНК серьезную проблему представляют ошибки в определении того или иного нуклеотида(ов). При нециклических методах секвенирования большинство ошибок возникает или из-за компрессии фрагментов ДНК при их разделении в секвенирующем геле, или из-за неспецифической терминации новосинтезируемой цепи ДНК, которая, в свою очередь, может иметь различные причины. В циклическом секвенировании ДНК, кроме этих причин, большое влияние на точность секвенирования оказывает и исходное количество самой матрицы ДНК. Так, было проведено специальное исследование, посвященное выявлению зависимости исходной концентрации матрицы в реакционной смеси и точности секвенирования [Hyder et al., 1994]. В этой работе было показано, что для фрагмента длиной 357 пн наименьший процент ошибок (1-3%) при циклическом секвенировании обнаруживался при изначальном количестве матрицы, варьирующим от 75 до 1125 фмоль. В другой работе, поставившей целью определение точности обычного секвенирования с использованием секвеназы и циклического, проводимого с помощью Taq ДНК-полимеразы, подсчитывали число ошибок, приходящихся на участки матрицы, по-разному удаленные от праймера [Коор et al., 1993]. Так, для первых 350 нуклеотидов количество ошибок не превышало 1%, тогда как даль- [c.159]

Выше на рис. 2.2 схематично показан весь описанный выше процесс, но следует отметить, что он несколько идеализирован. При его выполнении экспериментаторов подстерегает множество нюансов, которые могут свести на нет все предварительные усилия. Так, и подготовка самой матрицы к секвенированию, и выбор затравочной молекулы, и определенное соотношение дНТФ/ддНТФ, зависящее, главным образом, от используемой ДНК-полимеразы, и мечение вновь синтезируемой цепи ДНК, и параметры секвенирующего геля, и даже особенности радиоавтографии зависят от конкретных задач и требуют тщательного исполнения. В этой связи последующие разделы этой главы и некоторые другие главы будут посвящены подробному анализу составляющих процесса ферментативного секвенирования ДНК. [c.48]

Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса. Так, если для метода секвенирования ДНК химической деградацией было необходимо наличие одно- или двуцепочечного фрагмента, нe 5ш eгo на одном (гомогенном) из своих концов единственную метку, то для секвенирования ферментативным методом необходимо наличие немеченной матрицы ДНК и при этом желательно одноцепочечной. Хотя, справедливости ради, следует отметить, что матрица ДНК, несущая какую-либо метку (включая и радиоактивную), в большинстве случаев не окажет заметного влияния на заключительный радиоавтограф из-за большой разницы в размерах самой матрицы и вновь синтезированной в условиях терминации цепи ДНК. Что касается матрицы ДНК, один из концов которой несет метку в виде молекулы биотина, то в этом случае возможна ее сорбция на твердой фазе, например, на магнитных частицах со стрептавидином и проведение так называемого твердофазного секвенирования. При этом выхода биотинилированной метки в заключительный раствор терминирующей смеси, содержащей комплементарную цепь ДНК, меченную уже как-то по-другому и предназначенную для нанесения на секвенирующий гель, даже не произойдет. [c.48]

Несмотря на то, что с помощью фаговых или фагмидных векторов получение одноцепочечных молекул ДНК не представляло особых проблем, желание не тратить на очистку одноцепочечной ДНК от прочно связанных фаговых белков заставляло исследователей разрабатывать подходы к секвенированию двуцепочечных молекул ДНК, не останавливаясь даже перед фактом, что качество получаемых результатов при секвенировании двуцепочечной ДНК всегда заведомо хуже, чем одноцепочечной. (Здесь понятия качество секвенирования и количество определенных при этом нуклеотидов очень тесно связаны, поскольку при более высоком качестве полос на радиоавтографе секвенирующего геля прочитать можно будет гораздо большее их количество.) Так, не взирая на потенциально худшие результаты, большое число работ посвящено описанию различных подходов по подготовке двуцепочечных матриц ДНК, пригодных для ферментативного секвенирования дидезокси-методом. Такой, казалось бы, неразумный подход объясняется повышением общей производительности всего процесса секвенирования ДНК за счет экономии времени как на очистку одноцепочечных матриц ДНК, так и на проведение необходимого переклони-рования вставки в специальный фаговый или фагмидный вектор. [c.54]

Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование (рис. 2.7) [Stahl et al., 1988]. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом. Справедливости ради следует отметить, что авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что [c.56]

Хотя и данный раздел имеет целью описать существующие способы внесения радиоактивной или какой-либо прочей метки во вновь синтезируемую цепь ДНК, секвенирование ДНК, не несущей никакой метки, также возможно, а поскольку метка служит для выявления фрагментов ДНК после их разделения в секвенирующем геле, то упомина- [c.108]

Главное отличие циклического секвенирования ДНК от большинства описанных в предыдущем разделе, пожалуй, заключается в особенностях проведения терминирующих реакций. Так, прямое секвенирование фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, может проводиться с помощью любой ДНК-полимеразы, включая и нетермостабильную секвеназу. Причиной тому служит весьма значительное количество матрицы ДНК, позволяющей осуществить ее детекцию в секвенирующем геле. А ПЦР в данном случае просто служит для наработки необходимого количества сначала двуцепочечной, а затем и одноцепочечной ДНК. Секвенирование же ДНК с помощью так называемой линейной ПЦР осуществляется посредством циклических этапов денатурации, отжига одного праймера и удлинения цепи в условиях ее терминации дидезоксинуклеотидами, причем последние присутствуют в смеси, начиная с первого цикла (рис. 3.7). Ввиду того, что в этих случаях происходит амплификация ДНК только в арифметической прогрессии (не приводящая даже к образованию полноразмерных продуктов), то исходным материалом, несущим изначально довольно большое число копий секвенируемого фрагмента, может служить, например, ранее клонированная ДНК. С помощью всего 30 циклов становится возможным получение такого количества продуктов реакции амплификации/терминирования, которое уже будет видно после электрофоретического разделения в секвенирующем геле. [c.152]

В описанном выше полуэкспоненциальном циклическом секвенировании ДНК процессы получения все новых копий полноразмерного продукта и образования терминированных цепей ДНК, предназначенных для их последующего секвенирования, происходят одновременно и оказывают очень сильное влияние друг на друга. Так, если будет превалировать второй процесс, то как таковой амплификации, приводящей к резкому увеличению числа молекул полноразмерного фрагмента, не произойдет, следовательно, недостаточное количество матриц ДНК для их копирования в условиях терминации (секвенирования) не позволит выявить эти продукты в секвенирующем гель-электрофорезе. Превалирующий первый процесс, хотя и приведет к заметной амплификации, все же не позволит увидеть лестницу секвенируемых полос ДНК по той же причине нехватки конечного продукта в виде специфически терминированных фрагментов ДНК. Поэтому идеальным вариантом можно было бы считать некое разобщение этих двух, одновременно протекающих в одной пробирке процессов - построение новых цепей ДНК (амплификация) и специфическое терминирование продуктов удлинения праймера (секвенирование). [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология