Мультиплексное секвенирование ДНК

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации (геномное и мультиплексное секвенирование, рассматриваемые в других главах) могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью поли-нуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5 -концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5 -углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, -чем 5 -выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже. [c.22]

Все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК методом Максама-Гилберта нельзя отнести к стратегиям случайного подхода, так как они основывались, как правило, на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК и были рассчитаны на получение конкретных субфрагментов ДНК или субклонов. В то же время возможность случайного раздробления крупного фрагмента ДНК физическими методами и получение на их основе субклонов для их последующего секвенирования методом химической деградации принципиально возможны, хотя и не производительны. При этом, однако, необходимо отметить, что совершенствование векторных систем и их использование для определения нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК химической деградацией по Максаму-Гилберту не смогло значительно повысить производительность этого метода, разве что, кроме, метода мультиплексного секвенирования. [c.237]

Следует отметить, что метод мультиплексного секвенирования получил дальнейшее развитие при определении нуклеотидных последовательностей ДНК ферментативным методом и поэтому в соответствующем разделе 8.6 данной главы рассмотрен более подробно. [c.239]

Рис. 8.28. Схема мультиплексного секвенирования фрагментов ДНК ферментативным

В настоящее время перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры преследует обычно несколько иные цели, чем тогда, когда этот метод только разрабатывался. Так, в большинстве случаев перенос ДНК из геля на фильтры осуществляется для последующей визуализации полос ДНК с помощью нерадиоактивной колориметрической или хемилюминесцентной детекции, описанной выше в разделе 2.6, Причем вкупе с мультиплексным секвенированием возможно последовательное многократное проведение этапов молекулярной гибридизации с определенным зондом, несущим ту или иную метку визуализация Д1Ж зонда после ее гибридизации с ДНК, находящейся на фильтре удаление зонда и проведение аналогичных этапов со следующим зондом, С фрагментами ДНК, находящимися в полиакриламидном геле, проведение подобных процедур принципиально невозможно и поэтому перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры занимает важное место в арсенале современной молекулярной биологии. [c.186]

Следует отметить, что необходимым условием осуществления мультиплексного секвенирования ДНК является перенос фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на мембранный фильтр, поскольку проведение всех этих последовательных процедур гибридизации, окрашивания, отмывки возможно только с мембранным фильтром. Второе условие заключается в прочной сорбции фрагментов ДНК на данном фильтре, выдерживающей многократные инкубации в различных растворах. В противном случае мультиплексное секвенирование будет просто невозможно. Немаловажное значение имеет тип используемой метки. Так, при использовании радиоактивной метки процесс выявления последовательностей всех матриц ДНК довольно продолжителен ввиду требующейся длительной экспозиции фильтра на рентгеновскую пленку, занимающей иногда несколько суток. Гораздо быстрее результаты могут быть получены с помощью хемилюминесценции такого субстрата, как 1,2-диоксетан. Считается, что каждый цикл мультиплексного секвенирования с его использованием требует 1 ч на гибридизацию с меченой пробой и 1,5 ч на все процедуры по выявлению гибридизационных сигналов [ reasey et al., 1991]. [c.299]

Обычно мультиплексное секвенирование проводится с немеченными фрагментами ДНК и уже потом выявление на фильтре секвенируемых полос ДНК зависит от специфической пробы, меченной тем или иным соединением (радиоактивностью, биотином и др.), что делает неизбежным этап блот-гибридизации. Однако было предложено интересное решение по мультиплексному секвенированию нескольких матриц ДНК, не требующее этапа гибридизации со специфическими пробами. Суть этого способа заключается в одновременном разделении в одном геле [c.299]

Несмотря на то, что для автоматического секвенирования ДНК подбираются красители с отличающимися спектрами эмиссии, все же полностью избежать перекрытия не удается. Один подход к решению данной проблемы заключается в синтезе все новых флурофоров с улучшенными спектральными характеристиками. Другой же состоит в недавно предложенном способе детекции не спектра эмиссии конкретного соединения, а времени его флуоресценции, измеряемой в наносекундах [Nunnally et al., 1997]. Так, после анализа различных красителей были выбраны наиболее подходящие для этой цели и в модельном эксперименте продемонстрирована их пригодность для автоматического секвенирования ДНК. Авторы отмечают, что такая характеристика флуорофоров, как продолжительность свечения, более дискретна для большинства красителей, нежели их спектры испускания света. Особую актуальность данный подход приобретает в связи с мультиплексным секвенированием ДНК, где необходимо одновременно разделять несколько по-разному меченных образцов [Не et al., 1998]. Так, другими авторами за счет детекции времени флуоресценции ряда красителей было осуществлено мультиплексное секвенирование ДНК, показавшее точность свыше 90% для 660 нуклеотидов [Lieberwirth et al, 1998]. [c.314]

Многие приборы позволяют осуществлять различный масштаб синтеза олигонуклеотидов, варьирующий обычно от 0,05 до 5 или даже 10 мкмоль. Крупные масштабы синтеза применяются при синтезе праймеров для диагностических целей. Для секвенирования же ДНК масштаб синтеза в 0,05 мкмоль часто оказывается избыточным. В связи с этим был разработан мультиплексный ДНК-синтезатор, позволяющий в автоматическом режиме осуществлять одновременный синтез 96 независимых образцов в полипропиленовом микропланшете с масштабом синтеза всего 0,02 мкмоль или 20 нмоль, что позволило резко снизить стоимость получаемых олигонуклеотидов [Lashkari et al., 1995]. Одновременный синтез 10 независимых образцов позволяет производить EMBL ДНК-синтезатор, характеризующийся к тому же экономным расходованием реактивов [Ansorge et al., 1996]. [c.77]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология