Методы приготовления образцов и получения контрастного изображения

Методы приготовления образцов и получения контрастного изображения [c.64]

Вероятно, наиболее эффектным методом приготовления образцов из разработанных за последние десять лет является методика Клянншмидта, позволяющая наблюдать молекулы ДНК. Основными достоинствами метода служат отсутствие артефактов, происходящих при высушивании, и получение исключительно контрастного изображения. Эта методика в настоящее время применяется почти в каждой биохимической лаборатории, причем для овладения ею достаточно всего лишь несколько часов. Каплю раствора ДНК в 0,5—1,0 М ацетате аммония, содержащем 0,1 мг/мл цитохрома с, наносят на стеклянную пластинку таким образом, чтобы она стекала по пластинке на поверхность 0,15— 0,25 М ацетата аммония (рис. 3-14). Когда капля достигает поверхности, по поверхности начинает распространяться пленка денатурированного цитохрома с. Эта пленка содержит некоторое количество вытянутых молекул ДНК, связанных с толстым слоем <100—200 А) денатурированного цитохрома с. Если поверхности пленки денатурированного белка коснуться сеткой, то к ней прилипнет капля, содержащая часть пленки. Если сетку с прилипшей каплей погрузить в спирт, водная фаза будет удалена, а пленка плотно свяжется с пленкой-подложкой на сетке. Используемая в настоящее время методика включает предварительное позитивное контрастирование уранилацетатом белок, адсорбированный ДНК, будет окрашиваться так же, как образующая фон пленка, однако избыток белка позволяет получить хороший контраст. Контраст еще более увеличивается (или создается, если не применялось окрашивание) при напылении металла (обычно платины) под очень малым углом при одновременном вращении образца. Поскольку ДНК в образце покрыта пленкой белка, металл будет накапливаться у комплекса ДНК — белок подобно тому, как у забора наметает сугроб снега, однако это происходит со всех сторон, так как образец при напылении вращается. В результате получается исключительный контраст (рис. 3-15). Этот метод можно использовать для определения длины ДНК, а также для установления, является ли она кольцевой или же сверхспира-лизованной. В некоторых условиях (обычно при добавлении к [c.77]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология