Геномные библиотеки

Рис. 4.14. Иммунологический скрининг геномной библиотеки (иммунологическое тестирование колоний). Клетки после транстформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроиеллю-лозный или найлоновый фильтр) так, чтобы их расположение в точности соответствовало таковому на чашке.

Векторы на основе бактериофага Л С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек час- [c.71]

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмидами в них можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания геномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг. [c.76]

Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга геномной библиотеки необходимо определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген. [c.68]

Создание геномной библиотеки [c.62]

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

Иммунологический скрининг В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологиче- [c.67]

Геномная библиотека (банк генов) представляет собой клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК данного организма. Фрагментация целого генома на отдельные участки значительно облегчает все генно-инженерные манипуляции и позволяет анализировать отдельные последовательности, проводить сравнительный анализ различных геномов по определенным участкам и, главное, выделять и работать с индивидуальными генами. [c.41]

Геномная библиотека, банк (библиотека) генов (Genome lihrary) Набор клонированных фрагментов ДНК, в совокупности составляющих индивидуальный (групповой, видовой) геном. Если речь идет о крупном геноме (млекопитающие), то получают хромосомоспецифичные библиотеки. [c.546]

ВАС-векторы получены на основе F-плазмид бактерий и содержат гены, ответственные за репликацию и копийность этих плазмид в бактериальных клетках, и ряд дополнительных последовательностей для облегчения клонирования. Емкость ВАС-векторов при собственном небольшом размере ( 7 т. н. п.) огромная — 100—300 т. н. п. Это позволяет во много раз уменьшить число клонов при получении геномных библиотек (см. ниже). [c.41]

При построении физических карт тех или иных районов хромосом или целых хромосом из геномных библиотек, содержащих крупные вставки (YA -, ВАС- или РАС-библиотек), наиболее приемлем метод картирования, основанный на использовании STS. STS — это короткий одно-копийный участок ДНК (примерно 100-300 п. п.), который можно вьшвить при помощи ПЦР с использованием уникального набора праймеров. Для получения протяженного контига, охватывающего значительный участок хромосомы, требуется большое число STS, находящихся на расстоянии 50-100 т. п. н. друг от друга. Напри- [c.462]

Таблица 36.4. Состав представительных геномных библиотек

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

Представительная геномная библиотека [c.42]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Идентифицированный ген образования клубеньков использовали в качестве зонда для обнаружения фланкирующих его участков хромосомной ДНК R. meliloti в геномной библиотеке. [c.318]

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

Скрининг библиотек. После того как радиоактивный зонд получен, просматривают геномную библиотеку или библиотеку кДНК для идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду и, следовательно, соответствующей анализируемому белку. [c.46]

Как видно из рис. 5-81, клоны геномной ДНК и клоны к ДНК существенным образом различаются. Геномные клоны представляют собой случайную выборку из всех нуклеотидных последовательностей ДНК данного организма. Состав геномной библиотеки не зависит от того, какой тип клеток был выбран для ее получения. В отличие от этого клоны к ДНК содержат лишь те участки генома, которые транскрибируются в мРНК. а так как в клетках разных тканей наборы синтезируемых молекул мРНК различны, то и библиотеки кДНК различны для разных типов клеток, используемых при их конструировании. [c.329]

Нри клоиироваиии геиов самой трудной задачей является распознавание в библиотеке тех редких колоний, которые содержат интересующий нас фрагмент ДНК Это особенно справедливо в отиошеиии геномной библиотеки, так как здесь, для того чтобы выделить нужный ген млекопитающего, приходится среди миллиона клеток разыскивать какую-нибудь одну Чаще всего для этой цели пользуются особой формой гибридизации in situ, основанной на высокой специфичности [c.331]

Рис. 5-85. Использование перекрывающихся фрагментов для картирования интересующего нас гена путем прогулки по хромосоме . Для того чтобы сократить время прогулки , наиболее пригодны геномные библиотеки, содержащие очень крупные клонированные молекулы ДНК. Зохвдом для каждого следующего клона служит короткий Р-фрагмент ДНК одного из концов предыдущего идентифицированного клона. Если, например, используется правый конец, то и перемещение происходит вправо , как в случае, представленном на этом рисунке. Короткий концевой фрагмент удобен в качестве зонда еще и потому, что это снижает вероятность присутствия в зогще повторяющейся последовательности ДНК, которая могла бы гибридизоваться со многими клонами из разных частей генома и тем самым прервать прогулку .

Для решения целого ряда задач желательно иметь способ, позволяющий легко выделять рекомбинантный провирус из инфицированных клеток путем молекулярного клонирования. В частности, это относится к использованию ретровирусных векторов для удаления интронов, так как клонирование провируса дает возможность после инфекциононго цикла получать кДНК-копии интересующего нас гена. Кроме всего прочего клонирование провируса наилучшим образом позволяет исследовать и подтвердить генетическую структуру любой ретровирусной конструкции после того, как она претерпела цикл вирусной репликации. Клонирование провирусов включает обычные генноинженерные манипуляции, в том числе создание геномной библиотеки и ее скрининг гибридизационными методами. Однако заметим, что это непростая задача ввиду того, что обычно лишь одна копия искомого провируса присутствует в клеточном геноме. [c.300]

Бактериофаг. Вирус, инфицирующий бактерии. Библиотека. Коллекция клонированных фрагментов, представляющих какой-либо геном. Различают геномные библиотеки (включают последовательности и интронов, и экзонов) и кДНК-библиотеки (только экзоны). [c.51]

Зонд (проба). Молекула, используемая для выявления специфических фрагментов ДНК, РНК или белка при блот-анализе. (Например, при скрининге геномных библиотек). Зондами могут служить молекулы кДНК, синтетические олигонуклеотиды или специфические антитела. [c.51]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология