Слияние клеток, методики

Еще 15 лет назад был разработан метод гибридизации соматических клеток для проведения генетических исследований на клеточных культурах. На его основе была создана методика генетической рекомбинации путем искусственно вызываемого слияния протопластов ее уже удалось с успехом применить на материале грибов и растений. Первичный продукт такого слияния-клетка, объединяющая в себе геномы обеих родительских клеток. [c.471]

Следует отметить, что многие исследователи предпочитают добавлять систему ГАТ сразу же после слияния, а культуры после слияния не трогать несколько дней (даже не открывать СОг-инкубатор), что объясняется тем, что клетки после слияния очень чувствительны к изменениям внешней температуры, наступающим при вынимании планшетов из СОг-инкубатора. Поскольку не проводилось сравнения этих методов в одной работе, трудно отдать предпочтение какой-либо из этих методик. [c.109]

Процедуру слияния мини-клеток с целыми клетками проводите с помощью ПЭГ, как указано в соответствующей методике. [c.20]

Сливайте мини-клетки с реципиентными клетками согласно методике слияния с помощью ПЭГ. [c.20]

Успех экспериментов по гибридизации будет зависеть от тщательного и адекватного манипулирования с клетками во время процесса слияния (см. разд. 4.3). Если первая попытка оказалась неудачной, то необходимо повторить эксперимент, следуя выбранной вами вначале методике. Опыт, полученный в результате первой попытки, гарантирует, что при второй вы проведете эксперимент более тщательно. Если же у вас по-прежнему возникают проблемы при культивировании гибридных клеток, то следует прибегнуть ко второй методике. Таким образом можно избежать ошибки, о которой вы не подозреваете (см. разд. 4.3). [c.124]

Предыдущий раздел может служить руководством для тех, кому необходимо получить МКА человека. Однако для решения той же задачи существуют и другие подходы, с которыми читателю целесообразно ознакомиться. В большинстве других методик используется не ВЭБ-трансформация, а гибридизация клеток. В некоторых работах свежевыделенные клетки периферической крови сразу же сливали с перевиваемыми клеточными линиями [13]. В других — перед слиянием клетки стимулировали митогенами [14]. В-лимфобласты, очевидно, гибридизуются [c.162]

Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

Вместо инкубации клеток в ПЭГ в течение 90 с при 37 °С (п. 5 основной методики слияния) можно центрифугировать клетки в ПЭГ 2 мин при 1500при комнатной температуре после этого продолжить процедуры по пп. 6—11. [c.15]

В 1975 г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомно14 технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены. В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линие11 миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай [1]. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль (ПЭГ) [2 ]. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы in vitro за несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена [3]. Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах [4-7 ]. [c.37]

Перед тем как рассмотреть некоторые наиболее существенные модификации, мы остановимся на двух основных методиках гибридизации, которые используются одинаково успешно. Они иллюстрируют возможность широких вариаций при осуществлении различных стадий метода без снижения эффективности гибридизации. В частности, в первом случае клетки после слияния культивируют в 96-луночной панели для микротитрования. Во втором случае гибридомы выращивают в 24-луноч-аых панелях для культуры тканей (объем лун ки 2 мл). В данном случае выбор панели может быть обусловлен как удоб- [c.123]

Большинство авторов рекомендуют добавлять ПЭГ медленно. Пробные тесты показали, что это не дает преимущества в случае методики А. Однако если, поместив ПЭГ на дно пробирки, попытаться распределить его в среде так, чтобы обеспечить контакт со всеми клетками, расположенными на стенках пробирки, то смешивание ПЭГа со средой праисходит очень медленно. Тем не менее крайне важно, чтобы после слияния ПЭГ разбавляли медленно. Несколько порций среды, добавленные приблизительно с интервалом в 1 мин, создают условия, удовлетворяющие этому требованию. Быстрое же разбавление ведет к осмотическому повреждению клеток. [c.133]

При осуществлении этой методики не использовалась щелочная среда КРМ1-1640 или Дюльбекко. Щелочные значения pH достигаются еще до стадии слияния промыванием клеток в свободной от сыворотки среде КРМ1-1640, после чего клетки оставляют в очень небольшом объеме среды на 5 мин для достижения температуры 37 °С. За это время среда защелачи-вается. [c.133]

Слияние клеток проводят в соответствии с методикой, описанной Гальфре и др. (СаИгё et а1., 1977). Для слияния используют культуры клонов, находящиеся в логарифмическо фазе роста. Их промывают один раз СР и ресуспендируют в концентрации 2-10 клеток/мл. В пластиковой конической пробирке на 50 мл смешивают по 5 мл (10 клеток) суспензии каждой из родительских популяций клеток, добавляют 40 мл СР и центрифугируют при 600 g 7 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл СР, отбирают 100 мкл суспензии для контрольных культур (см. ниже), а оставшиеся клетки (18-10 > [c.287]

Именно новейшая иммунологическая методология — основное содержание этой книги. В ней определены наиболее существенные методические достижения последних лет разработка способов культивирования и выделения клонов иммунокомпетентных клеток методика слияния В-клеток, образующих антитела, с клетками плазмоцитомы н последующее клонирование гибридбм, синтезирующих моноклональные антитела (иммунодиагностические реагенты, прикладное значение которых трудно переоценить) методы аналитического и препаративного разделения такой тонкости и чувствительности, которая позволяет анализировать ианомолярные количества антигенов и из общей смеси иммуноглобулинов выделять антитела, синтезированные одиим-единствениым клеточным клоном (в этом отношеиии поразительно эффективно изоэлектрофокусирование в тонком слое). [c.5]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология