Рестриктирующие расщепление геномной ДНК

Исследование сател.гитных ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз. В исследовании природы сателлитных ДНК, как выделенных с помощью равновесного центрифугирования, так и криптических, большую роль сыграли опыты по эндонуклеазному расщеплению с последующей блот-гибридизацией. Значительно прояснили картину клонирование и секвенирование этих необычных геномных сегментов. [c.189]

Существует три источника вставок для клонирования 1) геномная ДНК, фрагментированная либо с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, либо физическими методами, например с помощью ультразвука 2) синтетические фрагменты ДНК, полученные химическим или ферментативным методом либо путем объединения этих двух методов 3) сегменты ДНК (кДНК), полученные с помощью ферментативного копирования РНК-матрицы in vitro. Нри расщеплении ДНК эндонуклеазами часто образуются фрагменты, способные к непосредственному лигированию с подходящими липкими или тупыми концами вектора. В других случаях соответствующие концы присоединяют к фрагментам перед лигированием. [c.277]

Эндонуклеазное расщепление. Наиболее прямой способ получения вставок состоит в расщеплении суммарной геномной ДНК какого-либо организма или вируса с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Метод отличается высокой воспроизводимостью специфический фермент разрезает данную ДНК с образованием уникального набора фрагментов. Если при эндонуклеазном расщеплении образуются липкие концы, соответствующие концам векторной молекулы, то клонирование осуществляют сразу или после обогащения популяции фрагментами для получения нужной вставки. [c.277]

А. Электрофоретическое разделение фрагаентов, полученных в результате расщепления эукариотической геномной ДНК с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Для визуализации фрагментов проводят окрашивание бромистым этидием. Слой геля толщиной от 0,5 мм до нескольких миллиметров наносят на твердую (например, стеклянную) подложку. Обычно гели готовят из полиакриламида или агарозы в забуференном солевом растворе. Б. Препарат ДНК переносят с геля на нитро-целлюлозный фильтр по методу, описанному в подписи к рис. 6.2, и гибридизуют с очищенной Р-меченной мРНК. На рисунке представлен радиоавтограф, полученный при наложении рентгеновской пленки на нитро-целлюлозный фильтр. [c.278]

Случайная фрагшнтащя геномной ДНК. Длинные молекулы ДНК легко ломаются даже при незначительных гидродинамических напряжениях, и их можно подвергнуть случайной фрагментации с помощью ультразвука, путем быстрого переме-щивания раствора или пропускания его через небольщое отверстие. Для получения случайного набора перекрывающихся фрагментов можно использовать и рестриктирующие эндонуклеазы, если проводить опыт в таких условиях, когда расщепление происходит лищь в небольщом числе имеющихся сайтов. Средний размер образующихся фрагментов зависит от величины прикладываемого усилия и от концентрации эндонуклеазы. Обьгано ДНК выделяют из больщой популяции клеток, поэтому исходные ее препараты всегда представлены больщим числом идентичных геномов. Каждый сегмент ДНК присутствует в конечном наборе во фрагментах разных размеров, что не позволяет очистить его перед клонированием. Тем не менее случайные наборы фрагментов имеют преимущество перед наборами, получаемыми в результате полного гидролиза рестриктирующей эндонуклеазой, поскольку вероятность нахождения хотя бы одной копии нужного сегмента целиком в одном фрагменте у них значительно выще. [c.279]

Характеристика клонированного сегмента. Прежде всего необходимо доказать, что клонированный сегмент действительно является репликой определенного геномного сегмента. Существует ли в геноме гомологичный сегмент с точно так же расположенными сайтами для рестриктирующих эндонуклеаз Этот вопрос имеет важное значение, поскольку во время репликации в системе хозяин-вектор иноща происходит клонирование случайных последовательностей, образовавщихся в результате рекомбинаций, делеций или мутаций. Основной подход состоит в использовании клонированной ДНК в качестве зонда для анализа продуктов эвдонук-леазного расщепления суммарной геномной ДНК, из которой произощел данный клонированный сегмент. Такой подход аналогичен описанному в разд. [c.333]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология