Векторная молекула

В целом к векторной молекуле предъявляются следующие основные требования [c.37]

На самом деле, реальные векторы должны обладать еще целым рядом свойств в зависимости от целей их применения. Так, очень важно, чтобы вектор позволял осуществлять вставку чужеродной ДНК различной молекулярной массы и чтобы свойства вектора давали возможность различать клоны бактерий, несущих исходные векторные и рекомбинантные молекулы. Удобно работать с небольшими по размеру векторами, которые к тому же дают большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку векторной и рекомбинантной ДНК. Векторная молекула должна иметь как можно больше единичных последовательностей, узнаваемых различными рестриктазами, что может обеспечиваться введением полилинкеров. Лучше всего разработана система вектор — хозяин для бактерий Е. соИ. В этом случае используется четыре типа векторов 1) плазмиды 2) бактериофаг Я. 3) производные бактериофага Я, (космиды и фазмиды) [c.143]

Применение Р. второго класса позволяет вырезать из ДНК определенные фрагменты, а также встраивать их в заданные места векторных молекул ДНК, т. е. направленно конструировать молекулы с новой генетич. информацией. [c.259]

Векторные молекулы. Трансформация. Ключевой операцией в генетической инженерии является введение в клетку и стабильное поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК. Это достигается при помощи так называемых векторных молекул, или векторов. Дело в том, что при обычном введении ДНК, например, в бактериальную клетку, она, как правило, подвергается атаке ферментов, которые гидролизуют ее на составные компоненты — нуклеотиды. В некоторых случаях ДНК выживает в клетке, однако в процессе деления клеток она не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном (интегриройаться в хромосому) и реплицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации. [c.35]

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (шти химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. [c.120]

Сайт встраивания (клонирования) ( loning site) Специфический участок векторной молекулы, в который встраивают фрагмент чужеродной ДНК. Очень часто это уникальный сайт рестрикции. [c.559]

П с ослабленным контротем репликации широко применяется в качестве векторных молекул в генетической инженерии для решения биотехно т задач [c.553]

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, ее разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями [c.117]

Адаптация генно-инженерных методов к этим видам микроорганизмов затруднена в связи с отсутствием удобных векторных молекул и способов введения в клетки коринебактерий чужеродной ДНК. Плазмиды обнаружены у многих коринебактерий, но все они оказались криптическими. До настоящего времени не удалось использовать ни один репликон других бактерий для создания векторов у коринебактерий. Имеющиеся векторы представляют собой гибридные молекулы, содержащие репликон криптической плазмиды коринебактерии и гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам из плазмид других бактерий (табл. 5). Сложность конструирования таких векторов связана не только с трудностью идентификации криптических плазмид, но и с тем, что внедрение селективных маркеров производится наугад, так как не известно строение репликона этих плазмид. [c.174]

История развития генной инженерии насчитывает не более тридцати лет. Ее становление связано с конструированием векторных молекул, получением рекомбинантных ДНК, а также включением в векторы генов животных и человека. Невозможно связать генную инженерию с одним каким-либо открытием, так как она представляет собой совокупность приемов и методов, направленных на создание искусственно модифицированных генетических программ. В предыдущей главе рассмотрены процессы генетической рекомбинации, происходящие при синтезе антител в природных условиях. Возможно эти процессы и явились толчком для проведения опытов, связанных с получением рекомбинантных генов искусственным путем. [c.499]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

Следующий раздел касается некоторых фундаментальных аспектов биологии ретровирусов, на которых базируется их применение в качестве векторных молекул. Разд. 9.3 дает представление о различных конструкциях ретровирусных векторов. В разд. 9.4—9.6 описаны методы размножения вирусов, инфицирования клеток и тестирования вирусных препаратов. Заключительный, разд. 9.7 касается некоторых практических вопросов, которые следует принимать во внимание при работе с данными векторами. [c.274]

Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

В основе этого подхода — использование векторных молекул, или векторов, в качестве которых применяли плазмиды сначала [c.267]

Однако наиболее широкое применение находят сравнительно короткие олигонуклеотиды. Для того чтобы придать фрагменту нуклеиновой кислоты необходимые для встраивания в определенный участок векторной молекулы липкие концы, синтезируются так называемые линкеры, т. е. двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие последовательность, расщепляемую той или иной рестрикционной эндонуклеазой. Обычно в качестве линкеров применяются самокомплементарные олигонуклеотиды длиной 8—10 нуклеотидных звеньев. На рисунке 213 демонстрируются некоторые типы линкеров. [c.377]

Идеальная векторная молекула должна обладать несколькими обязательными свойствами. Во-первых, любой вектор должен длительное время существовать в популяции клеток-хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток. Во-вторых, в любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках. В-третьих, структура векторной молекулы должна допускать встраивание в нее чужеродной последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной целостности. Для конструирования векторов в генной инженерии используют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, способные к автономной репликации в бактериальных и эукариотических клетках - плазмиды и эписомы, хромосомы вирусов, а также фрагменты хромосом эукариотических клеток. [c.68]

Поэтому для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая кДНК или синтетическая ДНК, содержащая кодирующую последоаательность, присоединяется в составе векторной молекулы к регуляторным элементам бактерии — промотору и рибосом-связывающему участку. [c.437]

Если кДНК в составе векторной молекулы способна к экспрессии, происходит синтез мРНК, а затем с мРНК — синтез белка, то ген можно идентифицировать по его продукту, например с помощью специфического иммунохимического метода обнаружения белка. Таким образом, используя один из этих методов или их комбинацию, можно доказать, что получен именно нужный ген. [c.44]

Использование ретровирусов в качестве векторных молекул за последние годы обрело статус наиболее перспективного и универсального метода введения и экспрессии клонированных генов в эукариотических клетках. Многие свойства ретровирусов делают их более удобными для таких исследований, чем методы прямого генетического переноса или использование потенциальных вирусных векторных систем. Во-первых, относительно небольшой геном ретровирусов позволяет довольно просто с ним манипулировать и вводить в его состав чужеродные гены таким образом, чтобы любой возникаюш,ий при этом дефект вирусной репликации мог бы комплементироваться по транс-схеме. Во-вторых, вирусы можно легко нарастить в культуре до высокого титра. Эффективность инфицирования пермиссивных клеток чрезвычайно высока, что в сочетании с высоким титром вирусных препаратов позволяет получать в культуре почти 100%-ное заражение клеток-мишеней. После инфицирования единственная копия ретровирусной ДНК оказывается стабильно интегрированной в геном клетки-хозяина строго определенным образом, так что практически все инфицированные клетки способны экспрессировать гены, привнесенные вирусом. Кроме того, ретровирусы содержат мощные транскрипционные знхансеры, которые существенно повышают уровень экспрессии клонированных генов в клетках различных типов. [c.272]

В первую очередь необходимо иметь хорошо отработанную систему хозяин — вектор. Под вектором понимается, как правило, небольшая молекула ДНК, способная к автономной репликации в определенном микроорганизме. Это может быть бактериофаг или плазмида. Естественно, необходимо иметь эффектинп1>1Й способ введения векторной и рекомбинантной молекулы в микроорганизм. Векторные молекулы должны обладать рядом свойств, позволяющих удобное введение чужеродной ДНК и ее последующую экспрессию. В настоящее время векторные системы очень хорошо разработаны для такой бактерии, как Es heri hia oli. Задача прикладной микробиологии — освоение систем хозяин — вектор для промышленных микроорганизмов бацилл, псевдомонад, актиномицетов, дрожжей и др. Успехи в этой области суммированы в обзоре Успехи микробиологии за 1983 г. [c.96]

Основными достоинствами коннекторного метода являются возможность его применения независимо от природы и способа получения фрагментов ДНК и высокий выход рекомбинантных молекул. Важно, что при таком способе воссоединения фрагментов ДНК не могут образоваться исходные кольцевые векторные молекулы. [c.142]

Векторная молекула должна обеспечивать также стабильное наследование гибридных молекул. Для обеспечения интеграции чужеродной ДНК в векторной молекуле необходимо присутствие сайтов расщепления рестриктазами, которые должны локализоваться в области, не существенной для репликации векторной молекулы. Наконец, векторная молекула должна нести хотя бы один генетический маркер, позволяющий фенотипически определить ее присутствие в клетке-хозяине. Любая молекула ДНК, обладающая данными свойствами, может использоваться как вектор. [c.143]

Щелочные фосфатазы бактерий (ВАР) и кишечника теленка ( IAP) катализируют удаление 5 -фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению З -концевой радиоактивной метки З2р а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5 -концевого фосфата. Удаление 5 -концевых фосфатных групп молекул вектора, линеаризованных с помощью одной рестриктазы во время подготовки его для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки. Гены секретируемых щелочных фосфатаз находят применение и в качестве высокочувствительных генов-репортеров при исследовании функционирования регуляторных элементов различных генов в прокариотических и дрожжевых системах экспрессии, а также в клетках млекопитающих [91]. [c.65]

Хотя векторы, несушие два (или более) селектируемых маркера, и позволяют в большинстве случаев отбирать бактерии, содержащие гибридные плазмиды, по инактивации одного из маркеров, однако для этого требуется перенос клонов трансформантов с одной среды на другую методом отпечатков. Это трудоемкая операция, особенно при анализе большого числа клонов. Поэтому в настоящее время сконструированы векторы, позволяющие производить прямой отбор клонов, несущих гибридные молекулы. Для этого в векторную молекулу вводят ген, выражение которого в определенных условиях вызывает гибель кпетки. Инактивация этого гена путем интеграции в него чужеродной ДНК делает трансформанты, содержащие гибридные л-олекулы, жизнеспособ- [c.145]

Применение методов молекулярного клонирования к актино-мицетам оказалось возможным благодаря разработке эффективных способов получения и регенерации протопластов, трансформации протопластов плазмидной ДНК и трансфекции фаговой ДНК, конструированию векторных молекул на основе плазмид и фагов. [c.166]

Поскольку в экспериментальных условиях невозможно работать с одной копией гена, создание необходимого числа идентичных копий гена (или его частей) является первой и одной из основных задач генной инженерии. Для ее решения используют метод молекулярного клонирования [61]. Сущность метода заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицирующиеся молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами. Далее такая последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях, обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой чужеродной последовательности нуклеотидов. Объединение молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является не чем иным как рекомбинацией ш vitro, поэтому такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами. [c.39]

Как уже упоминалось выше, фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.о. Однако этого явно недостаточно, чтобы клонировать целиком многие гены животных и растений, длина которых зачастую превышает 35-40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами (рис. 9). Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены соз-сшты ДНК фага X. Отсюда происходит название всего типа данных векторов ( 6)5mid). В ДНК нормальных фаговых частиц os-сай-ТЬ1 расположены на концах молекул, они разделяют мономеры фаговой ДНК в конкатемерах, объединяющих несколько соединенных голова к хвосту мономеров, которые являются предше- венниками зрелых фаговых ДНК перед упаковкой в фаговые Частицы. В таких конкатемерах соседние сш-сайты располагают- [c.83]

Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для А,-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий. [c.85]

Смотреть страницы где упоминается термин Векторная молекула: [c.122] [c.473] [c.301] [c.371] [c.372] [c.373] [c.34] [c.36] [c.44] [c.27] [c.260] [c.171] [c.142] [c.143] [c.145] [c.149] [c.172] [c.176] [c.79] [c.69] [c.73] [c.75]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология