Мутационное клонирование

Использование фаговых векторов открывает большие перспективы для клонирования генов биосинтеза антибиотиков с помощью метода мутационного клонирования. Сущность метода заключается в возникновении мутантов, не способных к синтезу антибиотика (Ant ) при включении ДНК фага по гомологии с клонированным фрагментом в структурную часть гена(ов) ant реципиентного штамма, в результате нарушения их целостности. Фаговое потомство мутантных штаммов, образуемое при вырезании профага по фланкирующим гомологичным повторам, содержит в составе фаговых геномов клонируемый фрагмент с геном ant или частью этого гена (К. hater, С. Brutan, 1983). [c.168]

Особый интерес векторная система фага фСЗ 1 представляет для метода мутационного клонирования. Этот метод разработали К. Чей-тер и К. Брутон в 1983 г., использовав в качестве вектора фаг фСЪ, у которого в геноме делетирован участок aft. Такой фаг способен интегрировать свою ДНК в бактериальную хромосому только за счет клеточной системы общей рекомбинации по областям гомологии. На основе векторного фага может быть создан банк генов любого штамма Streptomy es. Гибридными фагами инфицируют клетки и селектируют лизогенные клоны, имеющие нарушения определенного хромосомного гена. Мутация происходит в том случае, когда гибридный фаговый геном интегрируется в целевой ген за счет клонированного в его составе фрагмента хромосомной ДНК. Фаговое потомство мутантных штаммов, образуемое при вырезании профага по фланкирующим гомологичным повторам, содержит в составе генома клонируемые фрагменты. С помощью данного методического приема удается достаточно просто выделять различные гены бактерии-хозяина. [c.278]

Наличие гомологичной рекомбинации между хромосомной ДНК клетки-хозяина и векторной ДНК, содержащей гомологичные хромосомной ДНК последовательности нуклеотидов, приходится учитывать при получении соответствующих генно-инженерных конструкций. Такая неконтролируемая рекомбинация в большинстве случаев нежелательна, так как может приводить к потере или структурным перестройкам клонированных фрагментов ДНК. Для того, чтобы свести последствия этого явления к минимуму, используют специальные штаммы клеток-хозяев, в которых общая система рекомбинации не функционирует, например, вследствие мутационной инактивации гена гесА Е. oli или гесЕ В. subtilis. [c.103]

Развитие генной инженерии облегчило процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения конкретных мутаций на основе генно-инженерных подходов называют направленным, или сайт-специфическим мутагенезом. Прообразом направленного мутагенеза является простая инкубация клонированного гена с химическими мутагенами in vitro, которая приводит к четкой локализации возникающих мутаций в пределах этого гена. В настоящее время разработано много эффективных методов сайт-специфического мутагенеза, позволяющих сознательно производить мутационные замены конкретных нуклеотидов. Получение заранее определенных мУ таций в сегментах рекомбинантных генов, введение мутантных [c.286]

Если принять во внимание частоту, с которой встречаются сайты связывания Spl в генах млекопитающих, то относительная избыточность Spl не кажется удивительной. Например, в одной клетке HeLa (часто используемая линия клеток, полученная из опухоли шейки матки человека) содержится от 5000 до 10000 молекул Spl. Благодаря высокой концентрации Spl удается получать этот белок в почти гомогенном виде, а также клонировать кодирующую его ДНК. Размер белковой молекулы, оцененный исходя из нуклеотидной последовательности клонированной ДНК, равен 80 кДа. хотя выделенный белок Spl имеет эффективную мол. массу 90- 100 кДа. Возможно, это связано с гликозилиро-ванием Spl in vivo, хотя для ядерных белков такая модификация не характерна. Мутационный анализ различных участков последовательности, кодирующей Spl, показал, что один из доменов этого белка необходим для присоединения к ДНК, а другие для активации транскрипции (рис. 8.34). Домен связывания ДНК находится вблизи С-конца и имеет три участка. Каждый участок содержит расположенные определенным образом остатки цистеина и гистидина, которые образуют хелатную связь с Zn (так называемые цинковые пальцы разд. 8.7.а). Изме- [c.55]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология