Геном рекомбинантные

В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделящиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр [c.493]

Рис. 21.7. Аденовирусный вектор. В клетку-хозяина, несущую интегрированный в геномную ДНК функциональный ген Е1 аденовируса, вводят встроенную в сегмент аденовирусного генома (0-17 единицы карты) плазмиду с терапевтическим геном (ТГ) и участок геномной ДНК аденовируса (9-100 единицы карты). Длина генома аденовируса равна 100 единицам. В результате рекомбинации (штриховая линия) между перекрывающимися участками плазмиды и ДНК аденовируса образуется молекула ДНК, эквивалентная полноразмерному вирусному геному. Рекомбинантная ДНК, содержащая терапевтический ген, упаковывается и высвобождается из клетки после лизиса. Образующиеся вирусные частицы дефектны по репликации. Плазмидная ДНК, входящая в состав конечной генетической конструкции, не влияет на упаковку рекомбинантной ДНК (не показано).

Существуют и другие, более близкие опасности. В 1974 г. Комитет по рекомбинантным молекулам ДНК Национальной Академии наук США обратился с призывом о прекращении экспериментов в двух направлениях, которые могут представить опасность для человечества в целом [269]. В своем обращении комитет подчеркнул, что использование Е. соИ для клонирования рекомбинантных молекул может оказаться опасным, поскольку эти бактерии обитают в кишечнике человека и могут обмениваться генетической информацией с бактериями, патогенными для человека. Комитет считает, что следует добровольно отказаться от исследований в двух указанных им направлениях, которые могут привести к случайному включению в хромосому генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам и к образованию токсинов, а также к развитию опухолей. Особые предостережения были высказаны в отношении любых планов, направленных на сцепление фрагментов ДНК животных с ДНК бактериальных плазмид или фагов. Предполагается, что контроль за проведением такого рода исследований должен осуществляться различными организациями, субсидирующими биохимические исследования [269]. [c.296]

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (шти химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. [c.120]

Таким образом, в сконструированных промежуточных рекомбинантных ДНК эукариотический ген будет находиться под контролем бактериальных регуляторных элементов. Целесообразнее встраивать ген в подходящий вектор для экспрессии, который уже [c.122]

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомбинантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа — трансформации — благодаря введению определенных генов. [c.144]

В настоящее время разработаны методы рекомбинации генов в экспериментальных условиях, позволяющие получить новые комбинации генов, не существующие в природе. Синтез рекомбинантных молекул ДНК - новый инструмент в генетических исследованиях, получивших название генной инженерии. В рекомбинации участвуют различные ферменты рестриктазы, экзо- и эндонуклеазы, трансферазы, ДНК-лигазы. [c.61]

Расщепление рестрицирующими эндонуклеазами имеет еще одно применение. Когда два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой с образованием фрагментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов могут образовываться новые комбинации генов -рекомбинантные ДНК (рис. 4.5). [c.55]

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

После того как рекомбинантный аденовирус инфицирует клетку-мищень, его ДНК проникает в ядро, где и происходит экспрессия терапевтического гена. Рекомбинантная ДНК не интегрирует в хромосому и сохраняется непродолжительное время, поэтому при проведении генотерапии с использованием аденовирусных векторов необходимо вводить их с определенной периодичностью. [c.494]

Отсутствие патогенности делает ААВ весьма перспективным вектором для доставки в организм человека терапевтических генов. Рекомбинантный ААВ получают с помощью котрансфекции клетки-хозяина, инфицированной каким-нибудь аденовирусом (вирусом-помощником), двумя плазмидами (рис. 21.8). Одна из них несет терапевтический ген, фланкированный инвертированными концевыми повторами (длиной от 125 п. н.) ААВ, а вторая - два его гена, гер и ap, ответственные за репликацию генома и синтез капсида соответственно. После [c.496]

Клонированные гены, рекомбинантные белки, моноклональные антитела, плазмиды, промоторы, векторы, кДНК, моновалентные вакцины [c.535]

Поскольку перенос хромосом доноров Hfr-типа прерывается спонтанно, для четкого определения последовательности генов рекомбинантным анализом нужно, чтобы рекомбинанты, несущие заведомо известные маркеры, были протестированы на наследование близлежащих перенесенных маркеров. Так, в случае скрещивания штаммов 12 и 14 (табл. 14.1) отбирают 200—400 трансконъюгантов типа Irp+NaK, очищают их и тестируют на наличие маркеров Hfr ага+, 1еи+, tonA+, ргоА+, 1ас+, ISX+, ригЕ+ и galK . Это делают следующим образом [c.116]

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рас-севают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры [235, 236]. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. [c.163]

Интерес к бакуловирусам как потенциальным переносчикам рекомбинантных генов и системам, обеспечивающим их экспрессию, возник после обнаружения их способности к синтезу большого количества вирусных белков на поздних стадиях инфекции. В частности, это касается вирусных полиэдрина и белка р10, гены которых находятся под контролем сильных поздних промоторов и которые могут быть удалены без ущерба для размножения вирусов. Поэтому замещение указанных генов рекомбинантными сопровождается усиленной экспрессией последних. [c.182]

Встройка в ДНК вируса осповакцины генов белков-иммуногенов различных инфекционных агентов позволяет создавать живые рекомбинантные вакцины, в том числе поливалентные, которые сохраняют все преимущества вируса осповакцины. Более того, встройка в геном рекомбинантных вирусов осповакцины генов таких цитокинов, как интерлейкин 2 и интерлей- [c.445]

Огромное значение для молекулярной биологии последнего десятилетия имеет развитие генетической инженерии (возникшей в 1972—1973 гг. П. Берг, П. Лобан, С. Коэн и Г. Бойер) и методов работы с рекомбинантными ДНК в сочетании с методами химического синтеза крупных фрагментов ДНК. В результате сделались доступными для исследования индивидуальные гены и регуляторные генетические элементы, было стимулировано изучение ферментов биосинтеза и обмена нуклеиновых кислот. Благодаря этому после 1977 г. были обнаружены мозаичное (экзон-интронное) строение генов, явление сплайсинга и ферментативной активности у РНК, усилители ( энхансеры ) экспрессии генов, многие регуляторные белки, онкогены и онкобелки, мобильные генетические элементы. Возникла белковая инженерия, которая позволяет получать новые, не существующие в природе белки. Молекулярная биология начала оказывать существенное влияние на развитие биотехнологии, медицины и сельского хозяйства. [c.9]

Общая, или гомологичная, рекомбинация характерна для всех живых организмов от вирусов и бактерий до многоклеточных эукариот. При гомологичной рекомбинации происходит обмен участками между гомологичными, т. е. очень похожими по последовательности, лтолекулами ДНК- Так, к сбщей рекомбинации относятся обмены между гомологичными хромосомами в мейозе у эукариот и рекомбинационная инициация репликации ДНК бактериофага Т4 (см. гл. ХП1). В первом приближении можно сказать, что гомологичная рекомбинация не создает принципиально новых последовательностей, а перетасовывает уже имевшиеся сходные варианты одной и той же последовательности (рис. 51). Чтобы подчеркнуть важность этого свойства, достаточно сказать, что при гомологичной рекомбинации между двумя сходными генами, кодирующими белок, оба рекомбинантных продукта оказываются не нарушенными, не происходит, например, сдвига рамки считывания, Другими словами, при гомологичной рекомбинации каким-то образом обеспечивается взаимное узнавание одинаковых (или очень сходных по последовательности) участков рекомбинирующих. молекул. Если же го.чологии нет, то и рекомбинация такого рода происходить не будет. [c.84]

Как уже говорилось, цепи ДНК в гетеродуплексе могут быть не полностью комплементарны друг другу. Судьба гетеродуплексных районов, образовавшихся в результате рекомбинации, может быть двоякой если неспаренные основания гетеродуплекса не репари-руются, то после репликации каждая цепь ДНК даст дуплекс с такой же последовательностью, как у молекулы ДНК, из которой она произошла (в случае рекомбинации в мейозе это приведет к пост-мейотической сегрегации) если же произойдет репарация неспаренных оснований, то инфор.мация, заключавшаяся в одной из цепей гетеродуплекса, исчезнет и заменится на информацию другой цепи. В отличие от других случаев рекомбинации в этом последнем случае один из двух возможных рекомбинантных продуктов исчезает и превращается (англ. onvert) в другой, поэтому этот вариант рекомбинации называют генной конверсией (рис. 57). [c.88]

Частичный перенос хромосомы из мужской клетки приводит к тому, что Р -клетка становится частично диплоидной (мерозигота), т. е. содержащей двойной набор многих генов. В такой частично диплоидной клетке между двумя хромосомами происходит обмен генетической информацией (генетическая рекомбинация) (рис. 15-2). Химические реакции, лежащие в основе этого процесса, имеющего важное значение для всех организмов, размножающихся половым путем, мы рассмотрим в разд. Ж- В конечном счете рекомбинационный процесс приводит к тому, что дочерние клетки, образовавшиеся при последующем делении, содержат только одну хромосому с обычным числом генов. Однако некоторые гены попадают в эту хромосому от каждого из родительских штаммов. Таким образом, может случиться, что клетка Р мутантного штамма, неспособная расти на среде без определенных питательных добавок, получит ген из мужской клетки, который позволит ей расти на минимальной среде. Хотя число таких рекомбинантных бактерий мало, тем не менее их легко можно отобрать из очень большого числа исходна смешанных мутантных бактерий. [c.191]

Как можно быстро обнаружить рекомбинантный бактериофаг Бензер использовал в качестве клеток-хозяев два штамма Е. oli штамм В и штамм К- Бактериофаги с мутантным геном гП образовывали характерные пятна в чашках с бактериями штамма В, но не росли на бактериях штамма К. Для того чтобы определить частоту рекомбинаций между двумя разными г//-мутантами, вирусы добавляли к жид- [c.249]

Какой бы механизм рекомбинации ни был предложен, в нем всегда должно быть учтено явление генной конверсии, или нереципрокной рекомбинации [220]. Это явление впервые было обнаружено при изучении генетики грибов, у которых можно отдельно исследовать каждый из четырех гаплоидных продуктов мейоза (тетрадный анализ, гл. 1, разд. Г, 2). Иногда вместо обычного менделевского отношения 2 2 для распределения генов в случае гетерозиготного локуса в потомстве наблюдали отношение 3 1. Это означает, что в одной из рекомбинантных. хромосом произошел возврат к родительскому типу. Механизм, лежащий в основе этого явления, может быть связан с неправильным спариванием оснований в гетеродуплексных участках. Чаще всего в точке,. [c.286]

В книге изложены традиционные и новейшие технологии, основанные на достижениях генной и клеточной инженерии. Рассмотрены прогрессивные методы биотехнологии, такие, как получение рекомбинантной ДНК, трансгенных растений и животных, культивирование клеток и тканей, клонирование, обеспечение сверхпродукгивности объектов. Значительное внимание уделено вопросам использования биотехнологических процессов для решения актуальных социально-экономических проблем — энергетических, сырьевых, медицинских, экологических, сельскохозяйственных. Обобщены главные достижения биотехнологии в современном производстве во многих разделах обсуждаются прогнозы ее развития. [c.3]

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, ее разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями [c.117]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ростом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Используя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1 — 2 тыс. копий на клетку без нарушения жизненно важных функций бактерий. Обычно же используемые плазмидные векторы поддерживаются в клетке в количестве 20 — 50 копий. Получение бактериальных штаммов-сверхпродуцентов плазмидных генов — одна из важнейших задач современной биотехнологии в экономическом, медицинском и социальном аспектах. [c.123]

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в . соН, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. соИ и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вьщеленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозя-ину легко тестируемый признак. [c.124]

Процедура вьщеления ДНК в клетки дрожжей довольно проста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая ин( а-ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компонент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку-хозяина придают ей этот недостаюший признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки подобно В. subtilis секретируют большое количество белка во внеклеточную среду, что используется также для секреции чужеродных белков, например интерферона человека (с. 43). [c.125]

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соедршенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК -клетками. Клетки ТК легко отличаются от клеток TK , поскольку способны расти на средах с ами-ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных бьши использовапы гибриды бактериальных плазмвд с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. соИ и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК -клетки. Анализ мето- [c.125]

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, — трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии. [c.127]

В настоящее время выделены гены и промоторы aSl-казеина, р-казеина, а-лактоальбумина, 3-лактоглобулина и сывороточного кислого протеина (WAP). Молочная железа — великолепный продуцент чужеродных белков, которые можно получать из молока и использовать в фармацевтической промышленности. Из молока трансгенных животных извлекают следующие рекомбинантные белки человеческий белок С, антигемофильный фактор IX, а-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин, сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназу и химозин. В большинстве проектов, за исключением а-1-антитрипсина и химозина, эти исследования пока еще на стадии разработки и ведутся в основном на трансгенных мьппах, поэтому оценивать их с точки зрения коммерческого интереса еще рано. [c.131]

Вышесказанное можно проиллюстрировать следующими примерами. В США осуществлен метод микроинъекции ДНК, отвечающий за экспрессию 3-лактоглобулина, который способен продуцироваться только в молочных железах животных. В Эдинбурге в 1992 г. были вьшедены трансгенные овцы с геном а-1-антитрипсина человека и 3-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. Обычно выход рекомбинантных белков в системах с использованием культуры клеток составляет около 200 мг/л, а у трансгенных животных он может повышаться до 1 л. Следует заметить, что создание клеточных культур и их выращивание в промышленных реакторах, а также выведение трансгенных животных и их обслуживание — дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные легко размножа- [c.131]

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

Основные этапы генно-инженерного синтеза соматостатина показаны на рис. 5.14. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 Е. соН вблизи конца гена, кодирующего фермент -галакгозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После выделения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибрид- [c.137]

Промежуточный и бинарный векторы. Эти векторы конструируются на основе Ti-плазмид. Промежуточный вектор получают путем ряда сложных операций. Сначала Т-область с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды, вставляют в вектор для клонирования в клетке Е. oli и размножают. Затем внутрь Т-области встраивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки А. tumefa iens, несущие полную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками Т-область рекомбинантной плазмиды, содержащая чужеродный ген, включается в Ti-плазмиду клетки хозяина, заместив в ней нормальную Т-область. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенньпли генами, заражают растения, где эти гены встраиваются в геном растительной клетки. [c.147]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология