Векторы, дефектные по репликации

В разд. 9.3.2 описаны принципиально различные типы векторов, дефектных по репликации. Альтернативная стратегия, предполагающая клонирование в репликационно-компетентных векторах, кратко рассматривается в разд. 9.3.3. [c.279]

Векторы, дефектные по репликации [c.279]

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

Рис. 21.7. Аденовирусный вектор. В клетку-хозяина, несущую интегрированный в геномную ДНК функциональный ген Е1 аденовируса, вводят встроенную в сегмент аденовирусного генома (0-17 единицы карты) плазмиду с терапевтическим геном (ТГ) и участок геномной ДНК аденовируса (9-100 единицы карты). Длина генома аденовируса равна 100 единицам. В результате рекомбинации (штриховая линия) между перекрывающимися участками плазмиды и ДНК аденовируса образуется молекула ДНК, эквивалентная полноразмерному вирусному геному. Рекомбинантная ДНК, содержащая терапевтический ген, упаковывается и высвобождается из клетки после лизиса. Образующиеся вирусные частицы дефектны по репликации. Плазмидная ДНК, входящая в состав конечной генетической конструкции, не влияет на упаковку рекомбинантной ДНК (не показано).

Ретровирусы можно рассматривать как природные векторы для переноса и экспрессии чужеродных генов. Ретровирусы с высокой степенью онкогенности быстро и весьма эффективно вызывают опухоли у млекопитающих и, как правило, способны трансформировать соответствующие клетки в культуре. За одним лишь исключением (разд. 9.3.3), эти вирусы дефектны по репликации, поскольку онкогенные последовательности клеточного происхождения заместили у них те вирусные последовательности, которые кодируют гранс-действующие функции [16]. Вирусные продукты, необходимые для репликации и интегра ции таких дефектных вирусов, обеспечиваются по транс-схеме не- [c.278]

Чтобы получить вирусный препарат на основе дефектного по-репликации рекомбинантного ретровирусного вектора, плазмидную ДНК, содержащую провирусную форму рекомбинанта, необходимо ввести в клетки, способные упаковать ретровирусную РНК в вирусные частицы. Для этой цели подходят, например, линии фибробластов, продуктивно инфицированные соответствующим хелперным вирусом — получается вирусный препарат, представляющий смесь рекомбинантного и хелперного геномов (разд. 9.4,2). Альтернативный вариант — использование ретровирусных упаковывающих клеточных линий для получения вирусных препаратов, свободных от хелперных компонентов. [c.287]

Отмеченные недостатки можно преодолеть, применяя в качестве трансдуцирующих векторов ретровирусы. В силу высокой эффективности инфицирования широкого спектра клеток ретровирусы обеспечивают наиболее подходящий метод интеграции чужеродных генов в хромосомы клеток. Инкубируя клетки костного мозга совместно с монослоем клеток упаковывающей линии, продуцирующей гибридный ретровирус, можно быть уверенным, что и без дополнительной селекции большинство клеток костного мозга, в том числе и стволовые клетки, будут инфицированы дефектным по репликации гибридным ретровирусом и ДНК-копия его генома будет интегрирована в хромосомную ДНК клетки. [c.410]

Клетки хозяина должны обеспечивать все условия для репликации векторной ДНК и не содержать элементов, подавляющих репликацию вектора или мешающих отбору. Так, нельзя использовать клетки, содержащие активную систему рестрикции, поскольку это угрожает целостности рекомбинантных ДНК, содержащих чувствительные сайты рестрикции. Также неприемлемы клетки, содержащие нормальные dam- и /ст-метилтрансферазы Е. соИ, поскольку в этих случаях образуются реплицированные рекомбинантные ДНК, устойчивые к используемым в экспериментах в качестве инструмента рестриктирующим эндонуклеазам (разд. 4.2.е). Применяя клетки, дефектные в отношении нормальных рекомбинационных функций, можно предотвратить возникновение нежелательных изменений во вставке. [c.228]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология